GST-甘油-3-磷酸脱氢酶的分离及纯化

为了解重组酿酒酵母GCY1基因表达甘油-3-磷酸脱氢酶的情况,试验采用SD-URA 2%半乳糖、3×YP+6%葡萄糖、SC-URA 2%半乳糖、SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl 4种培养基诱导培养粉碎破壁酵母,采用蛋白质全自动高速纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子量。结果表明:含有GCY1基因的酿酒酵母在25℃下振动培养48 h其3×YP+6%葡萄糖培养物的OD600值为8.75,SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl培养物的OD600值为7.35。采用Profinia低压液相色谱纯化,只有SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl培养基中酿酒酵母表达了甘油-3-磷酸脱氢酶,且经SDS-PAGE凝胶电泳测得分子质量为65 ku。     

Saccharomyces cerevisiae谷氨酸脱羧酶的诱导纯化及其活性的研究

为了了解酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)谷氨酸脱羧酶(GAD)的情况,分别用酵母提取物及胰蛋白胨(3×YP)+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基进行诱导培养,粉碎破碎酵母,采用ProfiniaTM蛋白质纯化系统纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子质量,同时研究了磷酸吡哆醛(PLP)对酿酒酵母谷氨酸脱羧酶(S.cerevisiae GAD)活性的影响。结果表明:转基因酿酒酵母在28℃振动培养47 h,3×YP+6%棉子糖培养基OD600值为7.4,3×YP+6%半乳糖培养基OD600值为6.8。棉子糖诱导的酿酒酵母没有表达目的基因,没有纯化到GAD;相反,半乳糖诱导的酿酒酵母表达了目的基因,纯化到了GAD,其分子质量为67 ku。PLP对GAD的活化作用较显著。     

产α-半乳糖苷酶菌株的筛选、鉴定及其酶学特性的研究

利用筛选培养基从不同豆制品作坊附近的土样中筛选出一株产α-半乳糖苷酶的菌株D-1,对其进行分子鉴定及所产的α-半乳糖苷酶进行酶学特性研究。研究表明,菌株D-1为Aspergillus niger,此菌株所产α-半乳糖苷酶的最适反应温度是55℃,在60℃以下热稳定性较好;最适反应pH值为5.0,在pH值3.0～5.5范围内稳定性较好,相对酶活>64.1%;Mg2+、Na+、Pb2+、K+、Mn2+、Co2+、Al3+对α-半乳糖苷酶均有不同程度的抑制作用,其中Cu2+和Fe3+的抑制作用较为明显,而Ca2+、EDTA(乙二胺四乙酸)、Zn2+对α-半乳糖苷酶有一定的促进作用。     

饲用α-半乳糖苷酶酶活稳定性的研究

在酶制剂生产加工和储存过程中,酶活稳定性是酶应用过程中最常遇到的实际问题。本文研究不同载体、高温高湿、金属离子、保存初始pH值、保护剂浓度和存储时间对体外α-半乳糖苷酶稳定性的影响。试验结果表明:①无机载体碳酸钙、元明粉和滑石粉对α-半乳糖苷酶活性影响很大,收率均为0%;有机载体中玉米皮粉效果最好,收率高达90.83%;其次是淀粉,收率为61.11%;稻壳粉收率最低,仅为44.72%。②湿度为17%,温度小于85℃,酶活损失率小于10%,说明该酶有较强的耐温能力,温度为90℃,酶活损失率达到16.2%,随着温度上升,酶活损失率开始增加,不利于酶活的保存。③Cu2+对该酶有抑制作用3,7℃恒温水浴4 h后酶活存留率仅为74%,Mn2+、Zn2+、Ca2+、Na+、K+和Mg2+对α-半乳糖苷酶有几近相同的保护作用,酶活存留率均大于92%。④该酶最适保存pH值为5.3;pH值为4.4时,酶活损失率达到30.1%,不利于酶的保存;pH值为5.6时,酶活损失率为3.77%,pH值在4.7~5.6之间,酶活损失率小于10%,有利于酶的保存。总之,过酸和过碱都不利于酶的保存。⑤1%NaCl、1%甘露醇、5%和7%的山梨醇都有杂菌产生,不利于酶的保存3;%~5%的NaCl酶活损失小于10%1,%和5%~7%的甘油酶活损失率小于5%,都有利于酶活保存。     

胰高血糖素样肽-2对体外培养的断奶仔猪小肠黏膜上皮细胞形态、增殖及其酶活力的影响

本试验旨在研究不同浓度的胰高血糖素样肽-2(GLP-2)对断奶仔猪小肠黏膜上皮细胞形态、增殖及其酶活力的影响.试验采用单因子试验设计,以体外培养的28日龄断奶仔猪回肠上皮细胞作为模型,细胞培养液中的人胰高血糖素样肽-2(hGLP-2)浓度分别为0、1×10-11、1×10-10、1×10-3、1×10-8和1×107mol/L,培养时间为144 h.结果表明,加入hGLP-2培养细胞96 h后,28日龄断奶仔猪回肠上皮细胞已具备单层柱状上皮细胞的典型特征,各试验组细胞数量均显著多于对照组(P<0.05),相对应的MTT OD值均极显著高于对照组(P<0.01);各试验组培养液乳酸浓度、总蛋白含量和蛋白质沉积量都显著高于对照组(P<0.05);各试验组的胞外碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶和肌酸激酶活力都极显著低于对照组(P<0.01),各试验组的Na+-K+-ATP酶活力都显著高于对照组(P<0.05).由此可知,GLP-2可以促进体外培养的28日龄断奶仔猪小肠黏膜上皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,维持细胞形态的完整性.     

蛹虫草菌固体发酵产α-半乳糖苷酶的优化

试验利用药食兼用的大型真菌蛹虫草菌固体发酵生产α-半乳糖苷酶,通过单因素试验优化了产酶培养基和培养条件。结果表明,以麸皮和菜籽粕为原料,物料比为3:1,诱导物为1%的刺槐豆胶,培养基初始pH值为6,料水比为1:1,在23℃培养96 h,优化条件下产酶活力为5.03 U/g,较优化前产酶活力(1.23 U/g)提高了约4倍。试验通过优化有效地提高了蛹虫草菌固体发酵生产α-半乳糖苷酶的活力。     

胰高血糖素样肽-2对28日龄断奶仔猪肠上皮细胞的保护及修复效应研究

本研究旨在探讨胰高血糖素样肽-2(Glucagon-like peptide-2,GLP-2)对28日龄断奶仔猪的肠黏膜上皮细胞(IEC)损伤后增殖、代谢、凋亡的影响及可能的作用机理.试验首先采用单因子设计,分别用1.2和2.4 mg·mL-1的β-伴球蛋白对原代培养的断奶仔猪肠上皮细胞进行攻毒,通过测定细胞增殖、代谢及凋亡的变化而建立细胞损伤模型;然后再采用2×3因子设计,考察添加不同浓度的GLP-2(1×10-9、1×10-8、1×10-7 mol·L-1)对致敏的肠上皮细胞的影响.结果表明,使用β-伴球蛋白攻毒,细胞MTT OD值显著降低(P<0.05),细胞蛋白质沉积量和细胞总蛋白含量极显著降低(P<0.01),胞外LDH活力极显著增加(P<0.01),Na+-K+-ATP酶活力显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)降低,半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)酶活力极显著(P<0.01)升高;使用β-伴球蛋白攻毒的同时添加不同浓度的GLP-2,细胞MTT OD值、细胞蛋白质沉积量、细胞总蛋白含量和Na+-K+-ATP酶活力均显著或极显著(P<0.05或P<0.01)升高,且随着GLP-2浓度的增加而升高,而胞外LDH活力则随着GLP-2浓度的增加而逐渐下降(P<0.05或P<0.01),caspase-3酶活力极显著(P<0.01)降低.提示β-伴球蛋白对断奶仔猪小肠上皮细胞的增殖和细胞完整性有不利影响,而GLP-2能够减轻或者避免β-伴球蛋白对断奶仔猪小肠上皮细胞的不利影响,这种效应可能是通过调节细胞Na+-K+-ATP酶、caspase-3等的活力变化并影响细胞代谢而实现.     

胰高血糖素样肽-2和二肽基肽酶Ⅳ抑制剂联合使用对断奶仔猪肠上皮细胞的影响

本试验旨在研究不同浓度的胰高血糖素样肽-2(Glucagon-like peptide 2,GLP-2)和二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制剂联合使用对体外原代培养的28日龄断奶仔猪肠上皮细胞增殖、代谢及相关酶活力的影响,初步探讨提高GLP-2作用效果的方法。试验首先采用单因子试验设计探讨不同浓度DPP-Ⅳ抑制剂(KR62436)对断奶仔猪肠黏膜上皮细胞增殖及代谢的影响;然后采用2×3因子设计,考察添加不同浓度的GLP-2(1×10-10、1×10-9、1×10-8 mol·L-1)和KR62436(0和1×10-11 mol·L-1)对细胞增殖、代谢及凋亡的影响。结果发现,培养液中单独添加1×10-11 mol·L-1 KR62436,细胞数量、MTT OD值、细胞沉积蛋白量、细胞总蛋白量、胞外LDH、CK和Na+,K+-ATP酶活均无显著变化(P0.05);当KR62436浓度升高到1×10-10 mol·L-1,细胞MTT OD值显著低于对照组(P0.05),胞外LDH和CK活力显著高于对照组(P0.05)。培养液中同时添加GLP-2和低剂量的KR62436,随着培养液中GLP-2浓度的增加,细胞数量、MTT OD值、细胞蛋白沉积量、细胞总蛋白含量和Na+,K+-ATP酶活力显著增加(P0.05),胞外LDH、CK活力显著降低(P0.05)。KR62436显著提高了GLP-2的作用效果。结果表明,低剂量KR62436对细胞生长的影响不显著,高剂量的KR62436对细胞的代谢和完整性有负面效应;但低剂量的KR62436能够促进GLP-2对细胞增殖、代谢和细胞完整性的作用效果。     

饲用α-半乳糖苷酶稳定性及酶学特性的研究

本试验系统研究了通过固态发酵法生产的饲用α-半乳糖苷酶粗酶的稳定性及其酶学特性。结果显示,该酶具有较强的耐酸性能,稳定pH范围在3.5～6.5。酶的最适温度在50～60℃,在70℃以下时基本稳定,酶在干热条件下稳定性比湿热高。α-半乳糖苷酶经过猪胃肠液处理活力下降,但仍能保持活力70%以上。较高浓度(1×10-3mol/L)的各种金属离子均抑制酶活,在低离子浓度(1×10-4mol/L)时,Co2+和Mn2+对酶活力有促进作用,两种浓度的Ag+和Hg2+均强烈抑制酶活。粗酶制剂在常温储存6个月时仍保留原始活力的90.30%,到9个月时有80.58%,可见酶制品在储存条件下稳定。     

α-半乳糖苷酶在小猪日粮中的应用效果

144头75日龄小猪随机分成3个处理组,每组设4个重复。1组为对照日粮组;2组别为对照日粮+300g/tα-半乳糖苷酶;3组别为对照日粮+500g/tα-半乳糖苷酶,此外,2组和3组的日粮在配方设计时,将豆粕的代谢能和氨基酸参数分别提高7%和5%,营养水平的计算值与1组相同。2组和3组的日粮配方成本比1组分别低41和25元/t(已扣除酶制剂使用成本)。通过连续40d(75～115日龄)的饲喂,结果表明,在3个组别之间,"增重"和"平均日增重"都没有显著的差异,而对照日粮组的"耗料量"略高于2组和3组。添加500g/tα-半乳糖苷酶的3组,其"料肉比"显著低于对照组;添加α-半乳糖苷酶的2组和3组每千克增重成本分别降低0.15和0.55元。因此,α-半乳糖苷酶在配方中的添加使用可以在不影响动物生长性能的前提下显著降低饲料的配方成本和养殖成本。     

黑曲霉变种产α-半乳糖苷酶菌株的筛选及发酵条件优化

试验研究黑曲霉变种产α-半乳糖苷酶菌株的筛选及发酵条件优化。黑曲霉菌株MX-H通过紫外诱变和传代培养后,得到一株能够变种产α-半乳糖苷酶较稳定的菌株MX-H1,并优化了MX-H1的产酶培养基。18S rDNA鉴定结果表明,菌株MX-H1被鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。结果显示,最佳优化条件为碳源15 g/L蔗糖、氮源10 g/L牛肉膏、产酶诱导物0.5 g/L棉籽糖、初始pH值6.0、培养温度为30℃、培养基装样量30 mL/250 mL、摇床180 r/min、培养96 h。在最佳优化条件下,发酵液中产α-半乳糖苷酶酶活力达到4.95 U/mL。试验为α-半乳糖苷酶的工业化生产提供参考依据。     

α-半乳糖苷酶和木聚糖酶在断奶仔猪日粮中的应用效果评价

本试验旨在研究α-半乳糖苷酶和木聚糖酶对断奶仔猪生长性能和消化性能的影响.选用135头平均体重为(7.4±0.8)kg的杜×长×大三元杂交断奶仔猪,设9个组,每组3个重复,每个重复5头猪,采用3×3两因子完全交叉试验设计,设3个α-半乳糖苷酶水平(0、0.008%和0.012%)和3个木聚糖酶水平(0、0.008%和0.012%).试验期为28 d,分为前期(1～14 d)和后期(15～28 d)2个阶段.试验结果表明:1)添加α-半乳糖苷酶和木聚糖酶对断奶仔猪前期和全期的平均日增重、料重比和腹泻率有显著影响(P<0.05);对断奶仔猪后期的平均日增重、平均日采食量和料重比有显著影响(P<0.05);其中添加0.008%的α-半乳糖苷酶和0.008%的木聚糖酶可显著提高断奶仔猪的平均日增重和平均日采食量,显著降低料重比和腹泻率(P<0.05);2)添加α-半乳糖苷酶和木聚糖酶可以提高断奶仔猪各种养分的消化率,其中粗蛋白质、粗脂肪和粗纤维的消化率达到了显著效果(P<0.05).由结果可知,α-半乳糖苷酶和木聚糖酶可一定程度上提高断奶仔猪生长性能和消化性能,以添加0.008%α-半乳糖苷酶和0.008%木聚糖酶的效果最好,且两者存在互作效应.     

不同培养条件对猪源链球菌生长状况的影响

为探究不同培养条件对猪链球菌2型生长状况的影响,笔者用紫外线分光光度计测定不同培养时间(2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、24 h和36 h)、温度(4℃、30℃、37℃、40℃和45℃)、pH值(5、6、7、8和9)、Na Cl浓度(1%、2%、3%、4%和5%)条件处理下,THB液体培养基中菌液OD600值。结果显示,该菌生长前12 h为延迟期,12 h～18 h为对数期,18 h后为衰退期。该菌在温度为37℃、pH值为7、Na Cl浓度为2%时生长状况最好。本试验结果为工业化生产猪链球菌灭活疫苗及防控猪链球菌病提供了基础资料。     

H5N1亚型禽流感基质蛋白M1基因的原核表达和纯化

为获得纯度大于90%的M1蛋白,构建重组质粒PET-22b-M1,将正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测分析表达形式和表达量,并经Ni2+柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白。结果表明:试验成功构建了pET-22b-M1表达载体;IPTG诱导后高效表达出分子质量约为28 ku的M1融合蛋白;纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,且获得的M1蛋白纯度达95.4%。     

凡纳滨对虾肝胰脏原代细胞培养体系的优化

试验目的是为研究优化凡纳滨对虾肝胰脏原代细胞的培养体系。试验基于MTT法,分析不同培养条件(包括培养基类型、p H值、渗透压、FBS添加量等因素)对凡纳滨对虾肝胰脏原代细胞培养体系的影响。结果表明:在p H值为7.6,Na Cl添加量为1.2%,FBS添加量为5%的2×L-15培养基中,凡纳滨对虾肝胰脏原代细胞生长状况最好。因此,通过改变培养条件,可以适当优化凡纳滨对虾肝胰脏原代细胞的培养体系,但未能获得良好的传代细胞。     

淋巴细胞活化基因-3蛋白表达与生物信息学分析

为了研究淋巴细胞活化基因-3蛋白的生物学特性,试验采用PCR方法扩增淋巴细胞活化基因-3胞外区序列,构建重组质粒,将重组质粒转染至HEK293感受态细胞中表达目的蛋白,并对目的蛋白进行SDS-PAGE及Western-blot检测,通过ProtParam软件分析淋巴细胞活化基因-3蛋白性质,通过SWISS-MODEL软件预测蛋白质结构。结果表明:PCR法成功扩增出目的条带,大小约为1 430 bp,1. 0%琼脂糖凝胶电泳显示酶切成功;经10%SDS-PAGE凝胶电泳分析,在68 ku处出现目的条带,目的蛋白成功表达;纯化后的蛋白质经Western-blot检测证明具有特异性;目的蛋白具有22种可能的折叠形态,理论等电点pI值为9. 08,蛋白质结构不稳定,亲水性较差。说明试验成功表达了淋巴细胞活化基因-3蛋白。     

高海拔酸菜中乳酸菌筛选与发酵特性研究

以青海高海拔自然发酵酸菜为研究对象进行优良乳酸菌的筛选及发酵特性研究,进行了形态鉴定,产酸性、耐盐性和耐亚硝酸盐的测定及还原牦牛乳发酵实验。结果分离筛选出了6株传代性能良好的乳酸菌B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5,均为单球菌;经发酵特性研究发现,在耐盐性生长实验测定中菌株B2-1在Na Cl浓度为5%时,吸光度仍达到8.31,所有菌株吸光度值随着Na Cl浓度的升高而下降;在耐亚硝酸盐性生长实验测定中,6株菌株均具有良好的耐受力,其中菌株J3-4耐受性最好,在NaNO_2浓度为150mg/L下,吸光度达到21.27;菌株B2-1的液体培养基p H值最低为3.59;菌株H4-1、H4-5发酵还原牦牛乳后凝乳状态最好,感观评价分数菌株H4-1最高为32分、菌株B2-1次之为30分,发酵牦牛乳的p H值中菌株B2-1最低为4.27、菌株H4-1的p H值为4.51,发酵牦牛乳持水力菌株H4-1最高达97%,菌株B2-1的持水力为90%。经综合评定菌株B2-1适用于牦牛乳奶酪发酵剂的开发,菌株H4-1适用于牦牛乳酸奶发酵剂的开发,菌株J3-4适用于发酵肉制品和酸菜发酵剂的开发。     

固态混菌发酵生产饲用复合酶制剂营养条件和培养条件的研究

黑曲霉变种(A.niger v.Tiegh)CGMCC1182、黑曲霉MA-56(A.niger MA-56)CGMCC2722和黑曲霉XY-1(A.niger XY-1)CGMCC1182分别为α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶生产菌株。为获得高产α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的复合酶制剂,通过单因素实验,研究了黑曲霉三种菌株在固态发酵条件下产复合酶制剂的培养基组成和培养条件。结果表明,黑曲霉混菌发酵生产复合酶的最适培养基组成为:麸皮∶豆粕为7∶3(m/m),在此基础上(以麸皮和豆粕总量为10 g计算)添加玉米芯1.0 g,魔芋粉0.1 g,葡萄糖0.5 g,(NH4)2SO4 0.2 g,NaNO3 0.1 g,MgSO4 0.1 g,KH2PO4 0.2 g,H2O 11 mL。产酶最适培养条件为:培养温度30℃,固形物与加水比1∶1,α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶接种比例为5∶6∶6,接种混合孢子悬浮液2.5 mL(以一支菌种斜面加30 mL无菌水为标准),300 mL三角瓶中装量8 g培养基,发酵60 h时,复合酶产量达到最优,α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三种酶制剂的活力分别可以达到221、894、10188 IU/g。     

凝结芽孢杆菌工业培养基的优化

采用单因素试验和正交试验设计的方法 ,优化凝结芽孢杆菌发酵培养基。结果表明,最佳培养基组成为玉米粉5 g/L、小麦麸皮10 g/L、氯化铵7.5 g/L、豆粕粉7.5 g/L、Na Cl 5 g/L、Mn SO4·H2O 0.3 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L,最适装液量为35 m L。此条件下经摇瓶培养,菌种数可以达到2.20×109cfu/m L,芽孢数为2.02×109 cfu/m L。     

不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。