基于16S rRNA基因的枯草芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

参照GenBank中登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因,设计1对引物,扩增片段大小为460bp的基因片段,该方法对枯草芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,对枯草芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立了枯草芽孢杆菌PCR检测方法。该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,为枯草芽孢杆菌的分离及鉴定奠定了良好的基础。     

兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立

为建立一种快速准确检测兔多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的PCR方法,本研究以P.multocida的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的P.multocida的16S rRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了P.multocida PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60 cfu/mL,采用该PCR方法扩增P.multocida标准株和分离株均能扩增出643 bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本实验所建立的P.multocida PCR检测方法快速、敏感、特异、可靠,可用于P.multocida的快速鉴定与诊断。同时用建立的PCR方法对临床疑似病兔的脏器分离菌进行扩增,可扩增出目的条带,与细菌的分离结果相一致。     

水貂肠道枯草芽孢杆菌的分离及16S rRNA鉴定

为了获得水貂的有益菌种,及研制毛皮动物益生菌制剂提供基础,并为进一步深入研究枯草芽孢杆菌提供参考,从健康水貂的肠道中分离纯化出1株枯草芽孢杆菌,编号为 P2,通过形态学观察、生理生化试验以及16S rRNA 序列分析及同源性比较进行综合鉴定,结果显示菌株 P2与菌株 Bacillus subtilis CICC 10023（GU980947.1）亲缘关系最近,同源性达到了99.9%,因此鉴定 P2菌株为枯草芽孢杆菌。     

禽波氏杆菌16S rRNA和ompA基因双重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽波氏杆菌(B.avium)16S rRNA和ompA基因序列设计引物,经PCR反应条件优化,建立了检测禽波氏杆菌的双重PCR方法。该方法能够同时扩增B.avium基因组中的16S rRNA和ompA基因的特异序列,而对禽源大肠埃希菌(Escherichia coli)、沙门菌(Salmonella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等菌株的扩增结果均为阴性。该方法对B.avium基因组DNA检测的敏感性可达1.25×10~4 copies/μL,对其菌液检测的敏感性可达1.2×10~3 cfu/mL,对临床样品的检测结果表明,建立的双重PCR方法与16S rRNA单一PCR检测方法符合率为100%。建立的双重PCR检测方法为B.avium的检测提供了快速、准确、灵敏、特异的检测方法。     

兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立和应用

以兔多杀性巴氏杆菌的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的多杀性巴氏杆菌的16SrRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了兔多杀性巴氏杆菌PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60cfu/mL,使用建立的PCR方法扩增兔多杀性巴氏杆菌标准株和分离株均能扩增出643bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本试验所建立的兔多杀性巴氏杆菌病原PCR检测方法敏感、特异、可靠。     

鲈鱼枯草芽孢杆菌的分离及16S rDNA基因分析

为了鉴定从健康鲈鱼中分离纯化的一株细菌的种属,采用细菌培养特征、生化鉴定和16S rDNA基因序列分析的方法进行试验。结果表明:该菌为革兰氏阳性杆菌,有鞭毛,能运动;能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯木聚糖、果糖、甘露醇、柠檬酸盐等,不能利用麦芽糖和丙酸盐,不形成吲哚;16S rDNA基因大小为1 462 bp,GenBank登录号为KP289263,菌株与枯草芽孢杆菌亲缘关系最近,同源性达到99%,因此确定该菌为枯草芽孢杆菌。     

鸭疫里默氏杆菌16S rRNA和dnaB基因的双重PCR检测方法的建立

为了快速、准确地鉴定鸭疫里默氏杆菌(RA),本实验根据RACH3株16SrRNA和dnaB基因序列设计引物,经引物筛选和PCR反应条件优化后,建立了检测RA的双重PCR方法。结果表明该方法对检测的所有不同血清型RA菌株均能扩增出364bp和627bp两条特异的目的片段,而对鸭致病性大肠杆菌、鸭源禽巴氏杆菌、肠炎沙门氏菌、黄杆菌等对照菌株的扩增结果均为阴性;该PCR方法对细菌HXb2基因组DNA和菌液的检测敏感性分别为17.33ng/mLDNA和2.9×10~3cfu/mL细菌。利用建立的双重PCR检测了RA感染鸭的肝脏和脑组织中的RA,结果显示该方法与细菌分离法符合率分别为100%(9/9)和77.8%(7/9),表明本实验建立的双重PCR方法可用于检测肝脏组织中RA。本研究建立的双重PCR方法既可以对分离的RA疑似菌株进行快速检测和鉴定,也可以直接用于临床样品中RA的检测。     

鸡致病性大肠杆菌16S rRNA PCR鉴定方法的建立

为了建立一种鸡致病性大肠杆菌的快速检测方法,本试验通过无菌采集疑似感染致病性大肠杆菌鸡的心、肝、脾、肾作为病料,经过细菌分离培养、生化鉴定和致病力试验,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物对3株致病菌进行PCR扩增,均得到了特异性扩增产物。并对扩增产物进行核酸测序和BLAST比对。结果显示,分离得到3株鸡致病性大肠杆菌(DZMG、DGCG1、DGCP3),扩增出的16S rRNA基因序列与鸡致病性大肠杆菌基因序列同源性为100%。提示该检测方法具有特异性高和简单快捷的特点。     

副鸡嗜血杆菌16 S rDNA PCR检测方法的建立

根据副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA基因序列设计一对特异性引物XZIC1和XZIC2,对6株副鸡嗜血杆菌进行PCR扩增。结果显示,该对引物对6株副鸡嗜血杆菌均扩增出与预期大小相一致的282bp片段,而对鸡毒支原体、禽巴氏杆菌、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、鸡喉气管炎病毒及葡萄球菌等9种病原体的扩增结果均为阴性。该PCR敏感性结果表明,本方法可以检测到10pg的副鸡嗜血杆菌DNA模板。采用引物XZIC1和XZIC2,对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料DNA进行PCR扩增,均可扩增出单一的282bp的片段。     

地衣芽孢杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

参照Gen Bank中登录的地衣芽孢杆菌促旋酶B亚单位(gyr B)基因,设计1对引物,扩增片段大小为507 bp的基因片段。该方法对地衣芽孢杆菌检测的灵敏性为1 pg总DNA量,对地衣芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立了地衣芽孢杆菌PCR检测方法。该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,为地衣芽孢杆菌的分离及鉴定奠定了良好的基础。     

炭疽芽孢杆菌PCR鉴定方法的建立

根据炭疽芽孢杆菌3种特异性毒力基因的序列,包括保护性抗原基因(pag)、荚膜基因(cap)和S-层蛋白基因(sap),建立多重PCR鉴定方法。该方法检测11株炭疽芽孢杆菌均为阳性,检测29株非炭疽的其他需氧芽孢杆菌属菌株均为阴性。该方法检测模拟血液样品的灵敏度是2×10~6 CFU/mL(每1mL血液样品最低含有2×10~6细菌),而样品增菌后的检测灵敏度是2×10~2 CFU/mL。制备加入炭疽疫苗菌株芽孢的模拟土壤样品,经增菌培养后,PCR检测灵敏度为3×10~4芽孢/g。另外,还设计了炭疽芽孢外壁结构蛋白基因BclA的鉴定引物,利用该引物的PCR扩增片段长度以及测序结果,能够有效区分Ⅱ号炭疽疫苗菌株和临床分离菌株,本研究能够为炭疽临床诊断和环境监测工作提供技术支持。     

基于16S rRNA作为基因条形码对生鲜肉品物种检测方法的建立及应用

采用并合成了1对16S rRNA基因通用引物,通过PCR方法扩增了牛、羊、鸡、猪4种动物生鲜肌肉组织的16S rRNA基因,建立了PCR检测生鲜肌肉组织样品物种来源的检测方法。利用该方法,对采自青海西宁及海西州餐饮市场的30份所谓牛羊生鲜肉样品进行PCR检测,均扩增出约422 bp长度的DNA条带,纯化测序后进行序列分析,发现其中检测出11份鲜肉样品为赝品,实为斑嘴鸭(Anas Poecilorhyncha)肉。16S rRNA作为条形码基因对生鲜肉品物种的检测具有快速、特异、敏感、准确等优点,可以作为临床上检测生鲜肉品物种的方法进行市场检测。     

特异PCR方法对枯草芽孢杆菌群的鉴定区分

根据枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌基因组中β-甘露聚糖酶基因上下游序列设计3对种特异引物。以中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏的33株枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌作为参考菌株,利用特异PCR方法对3种枯草芽孢杆菌群细菌进行鉴定区分。结果表明该特异PCR方法能够有效区分枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。     

基于gyrB基因建立快速检测沙雷菌的PCR方法

选择gyr B基因作为靶基因设计特异性引物用于沙雷菌属的PCR检测,该特异性引物扩增产物的片段大小为279 bp。研究所选用的14株沙雷菌分别代表沙雷菌属的7个不同种。此外,2种沙门菌、2种克雷伯菌以及其他5种肠道菌用于进行引物特异性的验证。结果表明:扩增的条带与预期的扩增产物片段大小一致,而非沙雷菌属的其他9个种属均没有扩增条带;该方法检测沙雷菌的最低检测限为9.785 pg。通过对4株从蜜蜂中分离所得的黏质沙雷菌和3株从进口鱼粉中分离所得的居泉沙雷菌进行检测,结果均为阳性。研究表明,基于gyr B基因建立的PCR方法在沙雷菌属的检测中具有特异性强、快速和灵敏度高等特点。     

鸭疫里默杆菌PCR快速检测方法的建立

为了建立一种能快速准确地检测鸭疫里默杆菌的PCR方法,试验采用GenBank中鸭疫里默杆菌42 ku主要外膜蛋白A的基因序列设计并合成1对引物,建立PCR方法,分别以21株来自广西各地区鸭场的鸭疫里默杆菌全菌体为模板,结果均能扩增出大小为660 bp的目的片段,经测序证实为鸭疫里默杆菌,而对鸭源大肠杆菌、鸭源沙门菌、鸭...     

鸭疫里氏杆菌PCR快速检测方法的建立

本试验根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌主要外膜蛋白A基因序列,在其保守区设计了1对引物,建立了检测鸭疫里氏杆菌的PCR方法,对鸭疫里氏杆菌进行检测,结果能扩增出预期片段,而金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。说明该PCR法具有较好的特异性,可用于鸭疫里氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定。     

蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中幼虫芽孢杆菌16S r RNA基因保守序列设计特异性引物和探针,经反应体系及条件优化,建立了检测P.larvae Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:该方法与其它病原无交叉反应;最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏度高100倍;重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3%。应用该方法对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析。     

基于线粒体16S rRNA基因扩增检测动物源性成分的方法研究

动物源性成分鉴定被广泛应用于食品和饲料以及多种生物制品的检测中,现有检测方法中基于16S rRNA基因的通用引物由于存在与部分物种的mt DNA序列错配,导致检测中可能会出现假阴性。本方法对16S rRNA引物进行了改进,提高了引物与多个物种mt DNA序列的匹配度,使得检测的特异性提高,适用范围更广。对近20种动物源性成分的检测显示均能获得良好的检测效果,同时还能根据产物大小初步判断动物种类,提高了检测的效率和准确性。