显色培养基在金黄色葡萄球菌检测中的应用研究

探讨葡萄球菌显色培养基在饲料微生物检测中的应用。利用Baird-Parker琼脂培养基和显色培养基对120份饲料样品进行金黄色葡萄球菌检测,疑似阳性的菌落进行unc基因的PCR扩增与测序验证。结果表明,显色培养基检出假阳性率(58.82%)低于普通培养基(73.91%)。显色培养基用于饲料中金黄色葡萄球菌的检测,能够有效抑制其它杂菌的生长,降低普通培养基检测的假阳性率。     

蜡样芽胞杆菌显色培养基在饲料检测中的应用研究

为探讨蜡样芽胞杆菌显色培养基在饲料微生物检测中的应用,利用普通培养基和蜡样芽胞杆菌显色培养基,对60份饲料样品中蜡样芽胞杆菌进行分离培养,疑似阳性的菌落提取基因组DNA,利用PCR扩增蜡样芽胞杆菌gyr B基因进行测序验证。结果表明,普通培养基和显色培养基检出的阳性样品分别为13例(21.7%)和10例(16.7%)。通过gyr B基因测序验证普通培养基和显色培养基检测方法的假阳性率分别为76.9%和70.0%。蜡样芽胞杆菌显色培养基用于饲料中蜡样芽胞杆菌的检测,能够有效抑制其他杂菌的生长,降低普通培养基检测的假阳性率,适用于饲料中蜡样芽胞杆菌的检测。     

3种病原菌多重IMS-荧光RPA检测体系的建立及初步应用

建立一种同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的快速、灵敏、高通量的检测方法。利用特异性免疫磁珠,在37℃条件下从200 mL样液体系中循环捕获目标致病菌。磁珠液提取DNA后,对3种病原菌进行多重IMS-荧光RPA检测。结果表明:针对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的检测限分别达到3.0、4.5和8.7 CFU/mL。使用新建多重IMS-荧光RPA方法对人工感染60份皮张、毛皮纺织品DNA样本进行扩增,结果显示与预期结果一致;对60份公共场所收集的皮张、毛皮、纺织品DNA样本进行扩增,结果显示有2个样本沙门氏菌阳性、1个样本大肠杆菌O157:H7阳性,3份阳性样品送测序,测序结果与GenBank检索沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 DNA序列一致。得出结论:建立的多重IMS-荧光RPA检测体系灵敏度、特异性、准确度符合要求,能够在2 h内完成对3种病原菌检测,可以作为快速应对此三类病原菌安全突发事件的检测手段。     

江苏某奶牛场健康奶牛体内产志贺毒素大肠杆菌的分离鉴定及其对小鼠致病性的研究

通过对江苏省某奶牛场连续6个月的定群、定畜跟踪调查,获得产志贺毒素大肠杆菌(STEC)在该牛场分布的广泛性、持续性和血清型多样化的资料,并对一些重要血清型分离株作致病性的鉴定.基于本实验室已经建立的多重PCR方法对stx1、stx2、eaeA、ehxA共4个基因进行检测,对检测出的阳性样品,非O157 STEC采用多重PCR结合CT-SMAC平板的分离方法,而O157 STEC通过免疫磁珠结合O157显色平板的分离方法.结果表明,该奶牛场STEC的初筛率为16.1%(112/696),分离率为11.1%(77/696).分离株属于35种O血清型和60种O:H血清型.该场的优势血清型为O4、O26和O93,O157在该场存在,但并非优势血清型.77个分离株中,stx2基因的检出率为68.8%,远远高于其它毒力基因,如stx1(19.5%)、eaeA(11.7%1)和ehxA(20.8%).该场分离到一些O157和O26血清型的菌株,对小鼠具有较强的致病性.奶牛是STEC的天然宿主,可健康带菌.除了O157STEC外,非O157 STEC中一些高致病力菌株对人类的健康也存在威胁.     

免疫磁珠富集法对牛源大肠杆菌O157∶H7分离鉴定的影响

为证明免疫磁珠吸附技术对牛源大肠杆菌 O157∶H7分离效率的影响,从新疆五家渠市、伊宁县、昌吉市3个牛场的采集18份粪样、162份肛拭子、10份饲料样、17份水样和36份胴体表面棉拭子样本,经EC肉汤增菌后,分别采用免疫磁珠富集后和直接进行SMAC和MUG试验进行选择性培养,然后对菌体rfbE基因和鞭毛fliC基因进行PCR检测,最后对疑似大肠杆菌 O157∶H7菌用生化试验进行符合性检测。结果2种方法分别从243份样品中分离到8株和4株大肠杆菌 O157∶H7,统计学分析该差异不显著。本试验结果表明,在实践中免疫磁珠吸附技术和普通方法相比虽然在统计学上差异不显著,但确实能够增加大肠杆菌O157∶H7的分离数量,这与以前的相关研究结果基本一致。     

采用IMS-RT-PCR方法快速检测肉制品中大肠杆菌O157

建立免疫磁珠分离法(immunomagnetic separation,IMS)与实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-PCR)技术相结合快速检测肉制品中肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157的方法。利用改良热酚-水法提取EHEC O157的O-特异性多糖(O-specific polysaccharides,O-SP)作为筛选抗原,制备抗EHEC O157 O-SP单克隆抗体。将PM 3-50纳米磁珠经3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后,与抗EHEC O157 O-SP单克隆抗体结合,得到偶联量为150μg/mg的免疫磁珠。免疫磁珠的最高捕获量为13748.33 CFU/0.2 mg,在肉制品中特异性捕获的最低检测限为2.2 CFU/m L。根据EHEC 0157血清型的特异性基因rfb E(Gen Bank登录号:S83460)设计引物和荧光探针,将IMS与RT-PCR相结合进行检测EHEC O157。当肉制品中EHEC O157含量≥1 CFU/g(2.5 g样本),免疫磁珠能捕获,并通过EC肉汤培养基增殖3h后,RT-PCR即可成功检测,全程只需6-7 h。IMS-RT-PCR相结合的检测方法,在大大缩短了检测时间的基础上,再次降低了EHEC O157的检测限,在防范肉制品源性致病性EHEC O157传染方面具有重要意义。     

某牛场粪源大肠杆菌0157∶H7的分离鉴定

为了解重庆市某牛场牛群大肠杆菌O157∶H7的感染情况,我们以牛场犊牛为研究对象,采集其新鲜粪便,经LB培养基增菌培养、免疫磁珠富集后,在山梨醇麦康凯琼脂上划线培养,最后PCR扩增eaeA基因目的片段,以此分离鉴定粪源大肠杆菌O157∶H7。结果显示：在所采集的39份犊牛粪便样品中,分离得到一株符合大肠杆菌O157∶H7生长特点且含有eaeA基因的菌株。     

免疫磁珠法分离大肠杆菌O_(157):H_7及毒力基因的PCR检测

为了了解新疆不同牛场中大肠杆菌O157:H7的流行情况,对新疆乌鲁木齐、伊犁地区、塔城地区多个牛场采集的粪样及水样样本的检测,样品经EC肉汤增菌、免疫磁珠富集后,用SMAC平板和MUG培养基进行初步筛选,再用rfb E和fli C基因对筛选后的疑似大肠杆菌O157:H7菌株做PCR检测,同时结合生化试验的方法进行符合性检验。结果从新疆3个地区不同牛场的208份样品分离得到5株肠出血性大肠杆菌O157:H7,检出率为2.4%。其中粪样检出5株,检出率为2.4%;水样未检出。生化试验结果表明,5株分离出的大肠杆菌O157:H7菌株与国标规定的O157:H7特性相同。表明,部分被检牛场存在大肠杆菌O157:H7威胁,应该引起重视。     

畜禽产品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测

为了解大肠杆菌O157:H7在畜禽产品中的带菌情况,采集2个屠宰场、福州市部分超市及农贸市场上的畜禽产品(猪肉、禽肉、蛋、内脏)631份.采集的样品经改良EC新生霉素增菌肉汤增菌后,增菌液用快速检测试纸条和酶联免疫反应测试盒进行检测;菌液涂抹于山梨醇麦康凯琼脂平板和大肠杆菌O157显色培养基平板,选取可疑菌落用乳胶凝集试剂盒进行检测,结果均未检出大肠杆菌O157:H7.     

科玛嘉显色培养基在检测饲料中沙门氏菌的应用评价

将随机抽检的95份饲料样本采用CAS显色培养基和常规实验室方法(GB/T13091-2002)进行沙门氏菌的分离培养和初步鉴定。经24h孵育后共有7份样本在CAS显色培养基上呈典型的紫色菌落,经氧化酶试验排除2份假阳性,其余5份阳性样本经用VITEKID32E进行生化鉴定和血清学试验确认,证实均为沙门氏菌属,CAS实际检出5份阳性,90份阴性,与常规法检测结果完全一致。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EMA-PCR检测技术的建立

肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌。为建立一种特异、灵敏的O157∶H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157∶H7活菌EMA-PCR检测方法。结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL。经EMA处理,从含有1%～100%O157∶H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段。因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高。O157∶H7 EMA-PCR技术的建立为O157∶H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景。     

牛源大肠杆菌O157：H7的分离及毒力基因鉴定

从2个牛场采集新鲜粪便,增菌后,免疫磁珠富集,涂布筛选性培养基,挑取可疑菌落用rfbE/fliC二重PCR和血清学方法鉴定。设计毒力基因stx1、stx2、eae、hlyA和tccp相应引物,针对O157：H7对分离株进行PCR鉴定。口服攻毒链霉素处理的BALB/c小鼠明确分离株致病性。结果显示,成功分离到7株出血性大肠杆菌O157：H7,并且有1株迟缓性发酵山梨醇麦康凯培养基。毒力基因检测显示,其中6株毒力因子表型为stx1-stx2＋eae＋hlyA＋tccp＋,另有1株表现型为stx1＋stx2＋eae＋hlyA＋tccp＋,各分离株tccp基因均为阳性,但携带的重复片段数量有差异。所采集样品中肠出血性大肠杆菌O157：H7的检出率高达12%。1×1010 CFU同剂量口服接种经PBS洗涤的5株O157：H7分离株全菌,小鼠存活率有差异分别为40%,50%,60%,20%,50%,各分离株在小鼠体内排菌时间也有差异分别为攻毒后7,9,13,13,15d。     

仔猪粪便中大肠杆菌O_(157):H_7的分离鉴定及敏感药物筛选

为了解吉林省猪大肠杆菌O_(157):H_7的携带情况、致病性及筛选出敏感药物,试验收集吉林省部分规模化养猪场猪的新鲜粪便180份,采用m EC肉汤增菌后涂布于大肠杆菌O_(157):H_7显色培养基中对可疑菌落纯培养,生化鉴定纯培养菌株,并用普通PCR法检测编码该菌O抗原的rfb E基因,其中阳性者采用荧光定量PCR方法检测编码该菌H抗原的fli C基因,同时筛选敏感药物。结果表明:共有3株菌被鉴定为O_(157):H_7出血性大肠杆菌,检出率为1.67%(3/180),均来源于腹泻仔猪粪便;生化鉴定结果符合大肠杆菌O_(157):H_7特征;普通PCR法和荧光定量PCR法均能检出目的片段;3株分离菌对磷霉素和丁胺卡那霉素的敏感性高,对红霉素、青霉素G、氨苄西林、利福平的耐药性高。根据部分猪场大肠杆菌O_(157):H_7的流行情况可初步掌握吉林省猪源大肠杆菌O_(157):H_7的流行情况。     

志贺氏菌显色培养基在饲料检测中的应用研究

探讨志贺氏菌显色培养基在饲料志贺氏菌检测中的应用。将痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌标准菌制备成10-5、10-6、10-7梯度稀释的菌液,对志贺氏菌显色培养基、HE琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂进行检测灵敏度的评价。利用人工污染饲料样品进行显色培养基和上述四种普通培养基检出率的测试。结果表明:志贺氏菌显色培养基和普通培养基的检测灵敏度均为10-7;对混合污染样品的检测中,显色培养基优于普通培养基。志贺氏菌显色培养基用于饲料志贺氏菌的检测,具有菌落形态易于分辨的特点,适合于饲料中志贺氏菌的检测。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7EMA-PCR检测技术的建立

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌.为建立一种特异、灵敏的O157:H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157:H7活菌EMA-PCR检测方法.结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL.经EMA处理,从含有1％～100％O157:H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段.因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157:H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高.O157:H7 EMA-PCR技术的建立为O157:H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景.     

江苏地区动物粪便及食品中大肠杆菌O157的生物学特性分析

收集江苏地区养殖场及农贸市场动物粪便及食品样品700份,经显色培养基筛选、PCR鉴定大肠杆菌O157,并分析其进化分群、毒力基因、生物被膜形成能力、耐药性和耐药基因,了解O157污染情况。分离得到16株大肠杆菌O157,在粪便和食品中的分离率分别为2.6%(13/500)和1.5%(3/200),进化分群显示D群占68.75%(11/16)为优势分群,68.75%(11/16)分离株能形成生物被膜。毒力基因stx1、stx2、hly A、eae的分布率分别为25%、37.5%、68.75%、63.16%。综合分析显示,不同来源菌株进化分群及毒力基因型相似。分离株的耐药率在56%以上,且至少同时耐受7种药物;耐药基因tet A、TEM、floR、cml A、aph3、aad A1、aad A2检测率50%~63%,其他耐药基因检测率小于30%。本研究表明动物粪便作为大肠杆菌O157的贮库,可能由养殖场感染动物并污染食品,威胁人类健康。     

应用全自动荧光酶联免疫法检测肉类中的大肠杆菌O157

肠出血性大肠杆菌是引起食物中毒的一类重要的致病性细菌,大肠杆菌O157是其中的一个重要的血清型。本研究采集冻肉样品,进行大肠杆菌O157检测,结果从鸡肉和鸭肉中各检出一份阳性样品,阳性率分别为5.9%和12.5%,从结果可以看出,我市冻肉中存在有大肠杆菌0157污染。     

定点屠宰场（点）猪肉中三种主要食源性致病菌污染情况调查

为了解本地生猪定点屠宰场(点)猪肉中的沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌3种食源性致病菌污染情况,对10个场(点)出场的猪肉进行抽样,采用沙门氏菌测试片、大肠杆菌O157:H7测试片及李斯特菌检测板进行快速检测,再用国标法对快速检测出的阳性样品进行复检鉴定。结果显示:50份样本中,检出沙门氏菌阳性7份,阳性检出率为14%;20份样本中,检出大肠杆菌O157:H7阳性1份,阳性检出率为5%,检出单增李斯特菌阳性5份,阳性检出率为25%。此外,还发现样本中存在细菌的混合污染,其中沙门氏菌和单增李斯特菌双阳性2份,3种菌全阳性1份。调查结果表明:本地屠宰场出场猪肉中,这3种主要食源致病菌污染情况较严重,特别是小型屠宰点,应引起监管部门重视,加快推进屠宰企业转型升级;快速测试片的检测结果准确性偏低,特异性差,需要尽快建立一种快速特异的检测方法,用于屠宰场的致病菌快速检测。     

与HEp-2细胞粘附现象相关的大肠杆菌O157基因的发现

将产志贺毒素大肠杆菌O157：H7菌株97094培养于含有不同质量浓度的萘啶酮酸(nalidixie acid，NA)的麦康凯(MacConkey)琼脂平板上，获得对NA有抗性的菌株。用含有自杀性质粒pRT733的供体菌SM10λpir(携带转座子TnphoA)和抗萘啶酮酸的97094菌株做接合试验，使转座子TnphoA转入受体菌97094，经过约200个接合试验，有503个菌株在含有Km、NA、XP的LB琼脂平板上形成蓝色菌落，说明在这些菌株中形成了phoA融合基因,并能表达phoA基因。在这503个Km^r，NA^r变异体中，有6株完全失去了对HEp-2细胞的局灶型粘附(local adherence,LA)现象。对构建的6株大肠杆菌O157 TnphoA变异体，克隆TnphoA及其两侧的大肠杆菌O157 DNA序列，用根据TnphoA融合接点处的phoA的DNA序列设计合成的寡核苷酸引物，对各克隆中TnphoA上游的大肠杆菌O157的DNA片段部分进行测序，测序结果做BLAST搜索，发现有4个变异体的TnphoA插入到已知的大肠杆菌O157紧密素基因eae中，有2个变异体的TnphoA分别插入到eae之外的核苷酸序列中，分别插入到一个功能未知的菌毛分子伴侣基因和一个功能未知的Z4182基因的上游。这项研究表明，除紧密素外，大肠杆菌O157尚有其他因子参与对真核细胞的粘附。     

广东10个屠宰场猪肉中3种食源性致病菌的检测

为了解肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和空肠弯曲菌等3种食源性致病菌在生猪屠宰场的污染情况。采集广东惠州和清远两地共10家生猪屠宰场498头猪肉样品,分别经改良EC新生霉素增菌肉汤、SC(亚硒酸盐胱氨酸增菌液)和Bolton肉汤增菌,用大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和空肠弯曲菌的特异性引物进行PCR扩增及测序检测,阳性菌液再分别涂抹于山梨醇麦康凯平板、DHL(胆硫乳琼脂)和Skirrow血琼脂,挑取疑似菌落再次PCR验证,计算检出率。结果显示,检出大肠埃希氏菌O157:H7阳性样本2份,检出率0.4%,检出沙门氏菌阳性样本70份,检出率14.06%,空肠弯曲菌未检出。结果表明,惠州和清远两地屠宰场均存在食源性致病菌污染情况,其中沙门氏菌污染较为严重,惠州地区检出率高于清远地区。提示屠宰场应加强屠宰过程中环境和加工用具的消毒,以保证屠宰环节的食品安全。