重组柞蚕溶菌酶在柞蚕蛹中的分泌表达及纯化

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统(AnpeNPV expression vector system)在柞蚕蛹体内分泌表达柞蚕溶菌酶(ApLz),并建立重组蛋白的分离纯化方法。选用柞蚕30 kD蛋白信号肽构建分泌型转移表达载体pApBacDual-N1/L21Ap30kDSP,将Aplz基因克隆至该载体中,重组DNA转化感受态细胞DH10B/AnpeBac^Δcc,通过抗生素抗性及蓝白斑筛选获得重组杆粒AnpeBac^Δcc/phAplz,并经PCR检测确认。重组杆粒DNA转染Tn-Hi5细胞后得到具有感染性的重组病毒Anpe-NPV^Δcc/phAplz。重组病毒感染柞蚕蛹6～7 d后收集柞蚕蛹血淋巴,利用His-tag Purification Resin和StrepTrap HP亲和层析柱对重组ApLz进行两步分离纯化。重组ApLz经SDS-PAGE和Western blot鉴定、蛋白质N端测序分析以及抗菌活性检测,结果显示,重组ApLz可以通过AnpeNPV表达载体系统在柞蚕蛹中得到分泌表达,经过两步层析分离得到的重组...     

犬瘟热核衣壳蛋白原核表达及蛋白纯化

犬瘟热病毒(CDV)是一种单链RNA病毒,作为转录因子合成蛋白,共编码六个结构蛋白,其中核衣壳蛋白N(CDV-N)是保守性较强的免疫原性蛋白,在病毒感染时能引起强烈的抗体反应,对于CDV的诊断具有非常重要的价值。本研究的目的是构建CDV-N蛋白原核表达载体,利用原核表达技术纯化CDV-N蛋白。利用DNAStar软件预测CDV-N蛋白抗原表位,选择588bp截短体用于原核表达。设计引物,以本实验室保存的pMD18-T-CDV质粒为模板,PCR扩增CDV-N588片段,并将其TA克隆至pMD18-T载体。通过酶切鉴定和DNA测序,从pMD18-T-CDV-N588质粒上切取CDV-N588片段,再将其亚克隆至pET30a原核表达载体,构建重组质粒pET30a-CDV-N588。该重组质粒转化大肠杆菌BL21,ITPG在37℃诱导表达His-CDV-N588融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western Blotting加以验证。相同条件下大量增菌诱导,Ni-NTA琼脂糖珠在变性条件下分离纯化His-CDV-N588融合蛋白,再次用SDS-PAGE和Western Blotting进行验证。结果表明:pET30a-CDV-N在大肠杆菌BL21中得到高效表达;SDS-PAGE和Western Blotting检测证实,我们成功纯化了His-CDV-N588融合蛋白。本研究为制备CDV-N588蛋白单克隆抗体和研制胶体金诊断试纸条奠定了基础。     

猪IP-10蛋白真核表达载体的构建

根据GenBank上发表的猪IP-10蛋白的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出目的片段,将扩增产物连接到表达载体pcDNA3.1上,进行序列测定和分析。结果表明,所克隆的目的基因的核苷酸长为312bp,共编码104个氨基酸。该基因片段与已发表的猪IP-10蛋白基因核苷酸序列同源性为100%,氨基酸同源性为100%。本试验为重组猪IP-10蛋白的生产及功能研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白真核表达载体的构建及表达

本文设计特异性引物扩增全长p30基因,得到585bp的目的片段,克隆至杆状病毒Bac-To-Bac表达载体pFastBac/NT-TOPO中,转化大肠杆菌DH10Bac进行同源重组,成功构建了含有p30基因的真核表达载体。转染Sf9细胞,回收得到重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达产物20kDa,与预期大小一致,能与AFSV阳性血清产生特异性反应。     

不同微生物诱导柞蚕溶菌酶基因的表达分析

溶菌酶是昆虫体液免疫的重要抗菌蛋白质,在昆虫抵御外源物质入侵过程中发挥重要作用。以柞蚕蛹为材料,采用大肠杆菌(Escherichia coli)、蛹虫草菌(Cordyceps militaris)、柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)及无菌水为诱导源,测定不同外源物质诱导柞蚕蛹血淋巴对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)的抑制活性,并根据柞蚕溶菌酶基因(GenBank登录号:DQ353869)设计引物,利用荧光定量PCR技术分析不同外源物质诱导柞蚕蛹血淋巴中溶菌酶基因的表达变化。4个诱导处理组的柞蚕蛹血淋巴均可以产生抑菌活性,但抑菌效果具有显著差异:诱导后72 h柞蚕蛹血淋巴产生明显抑菌效应,抑菌圈直径由小到大依次为无菌水处理组、蛹虫草菌处理组、柞蚕微孢子虫处理组、大肠杆菌处理组,且雌蛹血淋巴的抑菌活性较强。4个诱导处理组柞蚕蛹血淋巴中溶菌酶基因的表达量在诱导后4～8 h内迅速上调,雌蛹和雄蛹中的表达量分别在诱导后24h、8～12 h达到最大,其中,大肠杆菌诱导溶菌酶基因表达上调迅速,但持续时间短,而蛹虫草菌和柞蚕微孢子虫诱导溶菌酶基因的表达量高。研究结果说明柞蚕的免疫应答时间和免疫相关基因的表达水平因诱导源而不同,雌雄个体之间也有差异。     

猪γ-干扰素基因真核重组表达质粒的构建

用RT—PCR方法从长白猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪γ-干扰素(IFN-γ)基因，经克隆测序表明与已发表序列同源性为100％。将目的基因插入表达载体pcDNA3．1( )，构建出真核重组表达载体IFN-γ-pcDNA。将重组质粒转染COS7细胞，检测转染细胞培养上清IFN-γ活性，结果表明转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒有抑制作用。     

猪PHGPx基因真核表达重组质粒的构建与鉴定

从猪睾丸中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法获得PHGPxcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pMD18-T载体连接,转入E．coli DH5α中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因cDNA进一步克隆到真核表达载体pGAPZ旺A中,经PCR及序列鉴定,证实插入载...     

绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。     

口蹄疫病毒真核表达质粒的构建及序列分析

根据定点突变的原理，获得包含有口蹄疫病毒Pl、2A、3C及部分2B编码区的目的基因片段，经KpnI和XbaI双酶切后，与经同样处理的真核表达质粒载体pcDNA3．1( )连接。经鉴定及DNA序列分析，口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到真核表达质粒载体pcDNA3．1( )上，且目的基因上的XbaI位点成功突变。     

牛FSHβ基因真核表达质粒的构建及表达分析

为开发可以体外合成牛促卵泡素(FSH)的表达系统,试验通过基因合成的手段获得牛FSHβ基因的目的片段,并通过酶切及T4 DNA连接酶的作用将FSHβ目的片段构建成pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,并针对构建的pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,采用菌液PCR、双酶切的方法对该重组质粒进行鉴定,并进一步利用293T细胞检测该重组质粒的表达情况。结果表明:菌液PCR和双酶切的结果证实了牛FSHβ基因片段插入了重组质粒中;pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中表达出绿色荧光蛋白,而且经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测发现pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中转录并翻译出牛FSHβ基因的蛋白表达产物。说明pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组表达质粒构建成功,并且可以在293T细胞中表达。     

鸡FSHR重组蛋白的异源表达及纯化制备

促卵泡素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)属于G蛋白偶联受体B亚族,是由676个氨基酸组成的膜蛋白。实验从海蓝白母鸡卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA并以此为模板设计FSHR特异性PCR引物扩增得到FSHR的开放阅读框架,然后将其连入pET21a原核表达载体,成功构建pET21a-FSHR-HIS表达载体,并将此载体转化到大肠杆菌E.coli BL21 star菌株中进行FSHR-His重组蛋白的诱导表达和纯化制备。结论:实验结果表明,试验成功地构建了FSHR-His重组蛋白异源表达载体,并能在E.coli BL21 star中正常表达可溶性的FSHR-His重组蛋白。     

长白猪CIDEB基因真核表达载体构建及生物信息学分析

本研究旨在从长白猪肝脏组织中克隆与脂质存储相关的CIDEB基因编码区全长序列,并进行生物信息学分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据NCBI中的猪CIDEB基因mRNA序列(登录号:NM001112688.1)设计特异性引物,采集长白猪新鲜的肝脏组织,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物与pcDNA3.1+载体连接,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后进行生物信息学分析。结果显示:长白猪CIDEB基因编码区序列全长为660 bp,编码了219个氨基酸,与人同源性最高,为92.2%。对长白猪CIDEB蛋白进行生物信息学分析表明,CIDEB蛋白属于亲水性蛋白,不存在跨膜结构,属于CIDE-N家族成员之一,不同物种的CIDEB蛋白具有很高的保守性,其二级结构α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占44.29%、18.26%、8.22%、29.22%。本实验成功构建了CIDEB基因的全长真核表达载体,并对其核苷酸、氨基酸进行序列分析,为进一步研究和揭示长白猪CIDEB蛋白的结构与功能提供了基础材料。     

关岭牛pEGFP-N3-UCP3重组真核表达载体的构建

旨在构建不含CMV启动子的pEGFP-N3-UCP3重组真核表达载体。利用PCR技术克隆UCP3基因启动子,扩增不含CMV区的pEGFP-N3载体片段,将UCP3启动子与该载体经连接、转化后,挑取阳性克隆进行PCR鉴定及测序鉴定。结果表明,成功地构建了重组载体pEGFP-N3-UCP3,为UCP3基因转录调控机制的研究奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因重组真核表达载体的构建

将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体pcDNA3的KpnⅠ酶切位点，快速筛选鉴定出含有HB核蛋白基因的重组质粒，经酶切、PCR及Southern鉴定为正向插入了HB核蛋白基因，将其命名为pcDNA-N。对重组质粒进行大量扩增，应用聚乙二醇纯化后，对SPF雏鸡进行了免疫攻毒试验，结果表明，IBV核蛋白在抗感染和抗致死方面具有一定的作用。     

柞蚕传染性软腐病病毒2C蛋白的表达纯化和酶活性分析

柞蚕传染性软腐病病毒是从感染吐白水软化病的柞蚕体内分离的一株小RNA病毒,属于软腐病病毒属(Iflavirus),含解旋酶结构域的2C蛋白是该病毒的功能蛋白质之一。以感染柞蚕软腐病病毒的柞蚕蛹c DNA为模板,PCR获得2C蛋白的编码基因,并利用Bac-to-Bac表达系统构建重组杆粒p Fast Bac-Dual-GFP-Hel 2C,在昆虫细胞Sf9中表达了该病毒的2C蛋白。对重组2C蛋白的三磷酸核苷水解酶(NTPase)活性和解旋酶活性进行检测的结果显示:重组2C蛋白具有NTPase活性,能够水解4种NTP,并且具有解旋酶活性,能够解旋3'端至5'端方向单链突出的双链DNA。初步推测2C蛋白在柞蚕传染性软腐病病毒复制中发挥水解三磷酸核苷和解旋DNA链的作用。     

hIL-18基因真核表达载体的构建及序列分析

在获得人白细胞介素18(hIL-18)基因重组质粒pGEM-T-hIL-18的基础上,用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切该质粒,回收小片段hIL-18基因;同时双酶切真核表达质粒pECFP-C1,回收大片段,二者连接转化大肠埃希菌感受态细胞.对重组质粒pECFP-C1-hIL-18进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,测序结果表明,克隆至pGEM-T中的IL-18 cDNA包含成熟IL-18的全部编码序列.本研究获得了融合有报告基因pECFP-C1的真核表达载体,为下一步进行hIL-18在真核细胞中的表达打下了良好的基础,亦为在基因水平上探讨hIL-18的生物学功能提供了物质基础.     

GFP-ESAT6融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

根据GenBank中发表的结核杆菌H37RV的ESAT6基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,用PCR方法扩增得到EsAT6基因DNA片段.将扩增片段克隆于pGM-T载体中,成功构建克隆载体pGM-T-ESAT6.分别将pET28a-GFP质粒和pGM-T-ESAT6质粒用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,并将纯化的ESAT6基因亚克隆至pET28a-GFP中,构建原核表达载体pET28a-GFP-ESAT6.将pET28a-GFP-ESAT6转化E.coli BL 21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western-blot分析,可见相对分子质量约37 200的外源蛋白带,表明GFP-ESAT6融合基因在大肠杆菌中得到了表达.用Ni-NT、A Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-ESAT6融合蛋白.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

为了表达并纯化猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)Cap蛋白,试验将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,但编码的氨基酸序列不变。合成优化后将ORF2基因全部基因序列,克隆于pET-30a原核表达载体并转化至大肠杆菌BL21中,经PCR和测序鉴定阳性克隆后,采用IPTG诱导表达目的蛋白。优化蛋白表达条件,采用Ni-NTA亲和层析胶纯化目的蛋白。结果表明:基因序列合成正确,无点突变。重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21中,经诱导表达出现约37 ku的蛋白条带,与预期分子量大小一致。优化表达条件后,加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG诱导6 h,表达产物含量最高。经Western-blot检测,能被PCV-2抗体阳性血清结合。说明成功构建了PCV-2 Cap蛋白的原核表达质粒pET-30a-ORF2,优化了表达条件并纯化出目的蛋白。