牛乳铁蛋白的研究与应用

乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物具有分泌功能的组织及其分泌液中,其生物学功能广泛。本文通过介绍牛乳铁蛋白的结构、功能及其在生产、生活中的应用,分析讨论了其应用前景和利用基因工程技术方法生产的优势,以期为牛乳铁蛋白相关的理论研究和生产应用提供参考。     

牛乳铁蛋白稳定性的研究

探讨牛乳铁蛋白在不同温度下的热稳定性，并研究其蛋白酶解稳定性性质。使牛乳铁蛋白在不同温度下处理一定时间，然后通过SDS—PAGE法检测其降解情况，并模拟胃液环境研究不同浓度胃蛋白酶对牛乳铁蛋白酶解的变化，根据电泳结果的灰度扫描计算不同时间消化后牛乳铁蛋白的残存率。结果表明，牛乳铁蛋白在一定时间内提高温度不会发生明显的降解，不同浓度的胃蛋白酶对牛乳铁蛋白的消化作用不同，牛乳铁蛋白对1μg／mL胃蛋白酶的抵抗能力最强，但是在被消化120min后牛乳铁蛋白残存率下降到1％左右。     

牛乳铁蛋白稳定性的研究

通过对牛乳铁蛋白在不同温度下处理一定的时间,研究牛乳铁蛋白热的稳定性,并模拟胃液环境研究不同胃蛋白酶浓度下,牛乳铁蛋白对胃蛋白酶消化的抵抗作用,研究其蛋白酶解稳定性。结果表明,牛乳铁蛋白在一定时间内,提高温度不会发生明显的降解,不同浓度的胃蛋白酶对牛乳铁蛋白的消化作用不同,牛乳铁蛋白对1μg／mL胃蛋白酶的抵抗能力最强。     

牛乳铁蛋白的功能

乳铁蛋白是一种乳制菌蛋白,也有调理素性质,在它的影响下,嗜中性粒细胞的吞噬活性加强。乳房发炎时,乳铁蛋白可增加20～30倍。在大肠杆菌型乳房炎,增加的趋向较葡萄球菌型和链球菌型乳房炎显著。患乳房炎的牛乳中乳铁蛋白含量为每毫升1～8毫克,表明乳腺在遭到病原攻击时能产生大量的乳铁蛋白,以抵御疾病的侵袭。正常情况下,每毫升血清中乳铁蛋白含量低于1微克,感染时乳铁蛋白合成明显增加,每天可高达30 g,其中约30%释放于血中,发挥其各种生理作用。血清乳铁蛋白的浓度升高可作为炎症反应的一个指标。通常存在于嗜中性粒     

牛乳铁蛋白ELISA检测方法的研究

本文建立了一种ELISA检测牛乳铁蛋白的方法。主要摸索了ELISA的工作条件,采用方阵滴定法确定抗原包被浓度和一抗稀释浓度,进而确定了二抗工作浓度,通过重复性试验和交叉性试验验证了该法的重现性和特异性。结果表明一抗工作浓度为1∶200000稀释,二抗工作浓度为1∶100000稀释,在此条件下检测牛乳铁蛋白的限度为1.56～100ng/mL,在此范围内,牛乳铁蛋白浓度与OD值之间呈指数相关,其回归方程为y=1.2770×(1.0145-e-0.0338x)(R2=0.9992)。本研究为研制牛乳铁蛋白检测试剂盒奠定了基础。     

免疫牛乳中乳铁蛋白的水平研究

应用ELISA法测定免疫牛乳中乳铁蛋白的水平,探讨除特异性抗体外,免疫乳治疗和预防感染性疾病的机制。结果表明,与非免疫牛比较,免疫牛的初乳中乳铁蛋白含量明显增高(P<0.05),提示特异性疫苗的接种对宿主合成乳铁蛋白等抗感染物质有促进作用。     

牛乳铁蛋白提纯方法的建立与电泳分析

乳铁蛋白（Lactoferrin,Lf）又称“乳转铁蛋白”,是一种广泛存在于人和大多数哺乳动物乳中,具有广谱抗菌性、抗病毒、增强免疫、抗氧化、促进铁的传递和吸收、平衡肠道菌群等作用。     

改进Tricine-SDS-PAGE法分析重组牛乳铁蛋白肽

为了有效分离3.1kDa乳铁蛋白肽,试验调整分离胶中聚丙烯酰胺浓度及凝胶的交联度,并加入适量甘油,改进了传统的Tricine-SDS-PAGE方法。结果表明,该方法与常规的SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE相比较,改进的凝胶不仅可以有效分离3.1kDa的肽,而且对分子量为212kDa的大分子量蛋白也有很好的分离效果,明显优于常规的SDS-PAGE和现有的Tricine-SDS-PAGE方法。     

牛乳铁蛋白及其活性多肽的研究进展

本文对牛乳铁蛋白(Lf)及其活性多肽(Lfcin)的结构、性质、功能特点、抑菌机制及分离方法等进行了详细的阐述,尤其对近年来Lf及Lfcin结构特点与功能关系的研究动态和未来的发展趋势进行了探讨。     

乳及乳制品中牛乳铁蛋白含量测定方法比较研究

目的 探讨两种不同检测方法测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白的含量及应用研究。方法 对比高效液相色谱（HPLC）法和超高效液相色谱串联质谱（UPLC- MS/MS）法测定生鲜乳、调制乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料和奶粉样品等乳及乳制品中牛乳铁蛋白的含量,并对测定结果进一步比较和分析原因。结果 两种测定方法均具有较高回收率和较优的重现性,但两者方法对实际样品的测定结果具有一定差异性。结论 HPLC法测定牛乳铁蛋白是通过肝素亲和柱纯化富集乳铁蛋白,测定的是非热变性牛乳铁蛋白的含量;而UPLC-MS/MS法测定的是热变性和非热变性牛乳铁蛋白的含量,不受热处理加工工艺的影响。实验室可针对不同检测目的选择不同方法进行定量研究。     

牛乳铁蛋白胶体金定量免疫检测试剂卡的研制

本试验旨在建立一种能快速定量检测乳制品中牛乳铁蛋白(BLF)含量的胶体金免疫层析方法。以BLF为免疫原免疫BLAB/c小鼠,用间接ELISA筛选、鉴定获得单克隆抗体;继而用胶体金免疫层析技术建立BLF的检测方法,并对研制的胶体金定量检测试剂卡进行重复性、线性、样本测试相关性和特异性评估。结果显示：本试验制得BLF单克隆抗体2株,效价均大于3.2×10~6;基于这2株单抗建立的BLF胶体金定量检测试剂卡的空白限为21.86μg/mL,变异系数(CV)<13%,线性测试其直线拟合线性回归相关系数R=0.997 7,与液相色谱法检测样本结果的相关系数R=0.988 5,与α-乳白蛋白和β-乳球蛋白均无交叉反应。综上,本试验研制的BLF胶体金定量检测试剂卡可为乳制品中BLF含量的检测提供一种准确、灵敏的方法。     

牛乳铁蛋白卵黄抗体的制备及纯化方法的建立

通过自制并初步纯化牛乳铁蛋白的卵黄抗体,用肌肉和皮下注射结合的方法罗曼蛋鸡进行免疫来制备多克隆抗体。选用150日龄的罗曼蛋鸡4只进行不同浓度的多次皮下免疫注射,采集卵黄抗体并用硫酸铵沉淀法进行抗体的初步纯化,经四次免疫后的罗曼蛋鸡卵黄抗体的效价分别达到了1：32000和1：24000,并在较高水平的情况下维持两周以上,同时经初步纯化后抗体纯度得到了很大提高。试验结果显示肌肉和皮下注射结合的方法对罗曼蛋鸡进行免疫来制备多克隆抗体是可行的,同时通过硫酸铵沉淀法纯化抗体可以达到试验的需求。     

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究

为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。     

高压处理对牛乳铁蛋白和乳过氧化物酶变性的影响

乳铁蛋白和乳过氧化物酶是具有生物学活性的乳清蛋白,有益于消费者健康,但其生物学活性在高压处理过程中容易发生变性。对传统的食品热处理加工方法而言,高压处理因其具有抗微生物效果而不改变食品的感官和营养品质,是一种较好的替代方法。本试验研究了高压处理对脱脂乳和乳清中乳铁蛋白和乳过氧化物酶变性的影响,随着缓冲液中蛋白的分离,在20℃时控制压力范围在450～700MPa。乳铁蛋白的变性是利用夹心ELISA法测定其与特异性抗体反应性的丧失来衡量的。乳过氧化物酶变性是通过分光光度计测定其酶活的丧失而确定的。各处理组乳过氧化物酶均未真正失活。在每次压力处理过后,测定残留的具有免疫反应活性的乳铁蛋白浓度,数据进行动态分析以获得D和Z值。随着压力和持续时间的增加,乳铁蛋白变性增加,乳清中乳铁蛋白的D值较牛奶中偏低,且乳清和牛奶中的D值比磷酸盐缓冲液中低。因此,缓冲液和牛奶中的蛋白变性速度要慢于乳清中蛋白的变性。在以上3种介质中乳铁蛋白的变性遵循的反应级数为n=1.5。在脱脂乳、乳清和缓冲液中处理得到了乳铁蛋白的活性体积分别为-34.77、-24.35和-24.09mL/mol,说明压力导致了蛋白体积的下降。     

牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备、纯化及定量检测

本试验旨在制备高纯度和特异性的牛乳铁蛋白多克隆抗体,为鉴定并定量检测牛奶样品中及奶牛乳腺组织中合成的乳铁蛋白提供试验材料。选用4只健康新西兰大白兔,初次免疫乳铁蛋白4周后进行加强免疫,每2周加强免疫1次,待血清达到抗体效价后,对兔进行心脏采血并分离血清,利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)法分别用于鉴定纯化后抗体的纯度和特异性。测定纯化后抗体效价,并绘制抗体抑制曲线。最后利用所得抗体对市售液态奶、奶牛乳腺组织匀浆液、奶粉样品中的乳铁蛋白进行定量检测。结果表明,本试验制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体纯度较高、特异性较强,抗体浓度为11.02 mg/m L,效价达到1∶128 000;采用该抗体测定的乳腺组织样品中乳铁蛋白浓度为16.13μg/g,液态奶中接近于0μg/g,奶粉中为5.28μg/g。总之,本试验采用经过饱和硫酸铵法和蛋白A树脂2步纯化后得到了纯度较高、特异性较强的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体,可以用于牛奶等产品的乳铁蛋白鉴定。     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA.真核表达载体pcDNA3.1(+)经Bam H I和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序.测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础.     

牛乳品质与卫生研究

<正> 1 牛乳成分及特性1.1 牛乳成分有:水分、蛋白质、脂肪、乳糖、无机盐、磷脂、维生素、酶、免疫体、色素、气体及其他微量成分。牛乳中各主要成分的含量,就同一品种大致是稳定的,但除饲养管理外,它们还随着牛的年龄、胎次、泌乳期过程、季节等而有些变化。掌握其变化规律有利于组织牛乳生产和加工。我们曾于1981～1984年对四川省不同牛种的牛乳主要成分进行测定(%):     

富铁牛乳的研究与开发

本文概述了铁作为一种必需的微量元素，在人体生长发育过程中的生理功能，介绍了富铁牛乳的生产工艺、通过实验确定了铁营养强化剂和产品配方。结果表明，产品具有铁含量高、性能稳定、口感好、吸收率较高等特点。     

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本试验以牛乳铁蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了3株稳定分泌乳铁蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C6、3F8和4D3,最后用相对亲和力最强的3C6所产生的抗体作为包被抗体,用辣根过氧化物酶标记过的多克隆抗体作为酶标抗体,最终建立了用于检测牛乳汁中乳铁蛋白含量的双抗夹心ELISA检测方法,该法对牛乳铁蛋白最低检测限为4 ng/m L,最适检测范围为4²56 ng/m L。