脊尾白虾E75基因克隆及E75、ECR和RXR在不同蜕皮分期的表达分析

本研究在克隆脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)E75基因(EcE75,GenBank No.KY471317)的基础上,探讨了其在蜕皮过程中的作用,同时也探讨了克隆脊尾白虾的蜕皮激素受体基因(EcECR)和维甲酸X受体基因(Ec RXR)在不同蜕皮分期的表达特征。克隆的EcE75基因全长为3944 bp,包括2520 bp的开放阅读框(ORF)。该开放阅读框编码一个由839个氨基酸组成的蛋白质,分子量为92.307 k Da,理论等电点为7.48。EcE75蛋白包含1个C4锌指结构,1个配体结合结构域,并且有1个明显的跨膜螺旋。EcE75基因在进化上具有一定的保守性,与甲壳动物聚为一支,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、黑背地蟹(Gecarcinus lateralis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)等亲缘关系最近。EcE75基因在脊尾白虾的各组织中均有表达,其中,眼柄中的表达量最高,卵巢次之。在不同蜕皮分期中,EcRXR与EcECR、EcE75的表达规律基本一致,生殖蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高。生长蜕皮和生殖蜕皮因为卵巢发育而存在明显不同,蜕皮激素对卵巢发育的刺激作用,通过EcECR、EcRXR和EcE75基因的表达上调可以体现出来。对EcECR、EcRXR和EcE75基因在不同蜕皮分期的表达研究,为了解虾蟹类蜕皮机制提供了参考信息。     

脊尾白虾Strawberry Notch1基因的克隆及免疫功能

为探究strawberry Notch1基因(SBNO1)在甲壳动物中的免疫功能,本文对脊尾白虾SBNO1的cDNA序列全长、系统进化、组织分布以及副溶血弧菌感染后SBNO1和Notch信号通路中相关基因表征进行了研究。结果显示,脊尾白虾SBNO1 cDNA序列全长4353 bp,共编码1380个氨基酸,预测相对分子量158.91 kDa,理论等电点4.81。qPCR分析显示,脊尾白虾SBNO1在各组织中均有表达,其中在肝胰腺里表达量最高,性腺次之。利用RNAi干扰SBNO1显示,脊尾白虾在感染副溶血弧菌后,干扰组死亡率显著高于未干扰组。副溶血弧菌感染脊尾白虾后显著影响了Notch信号通路中SBNO1、Numb与Delta在肝胰腺中的转录情况,而Jagged表达差异不显著。SBNO1和Numb的表达量随时间变化都呈现出先上升后下降的趋势,Delta的表达量呈现出先下降后上升的趋势。结果表明,Notch信号通路参与了脊尾白虾副溶血弧菌感染后的免疫。本研究有助于阐明无脊椎动物先天免疫的机制,为抗病脊尾白虾的分子育种提供理论依据。     

脊尾白虾隐花色素基因cry1的克隆及其功能分析

为探究隐花色素基因(cryptochrome,cry)在甲壳类中的节律调节功能,本研究根据脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)转录组序列,利用RACE技术获得了脊尾白虾cry1基因cDNA序列全长并对其进行功能分析。脊尾白虾cry1基因全长2190bp,开放阅读框1845bp,5’端非编码区为241bp,3’端非编码区为104bp,共翻译出614个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为70.5kDa,理论等电点为5.09。同源性分析显示,脊尾白虾cry1基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannameiS)的同源性最高,为71.6％。荧光定量分析结果表明,脊尾白虾cry1基因在眼柄、鳃、心脏、胃、肝胰腺、性腺、肌肉、肠道和腹索神经中均有表达,其中眼柄的表达量最高,性腺和心脏次之；不同时段的表达结果表明,其表达量在日节律(24h)中表现出先下降再上升的趋势。不同光色条件下RNA干扰(RNA interference,SRNAi)结果显示,注射后3~6h蓝光光照下脊尾白虾cry1基因的表达量显著高于白光光照,9~24h蓝色和白色光照下的表达量无显著差异,而RNA干扰组的表达量显著低于对照组,此结果显示cry1基因可能主要响应蓝光周期节律。目前对甲壳类生物钟的研究较少,该研究为深入探究甲壳类生物钟基因的调控机制提供帮助。     

脊尾白虾EcR基因的克隆及其在卵巢和胚胎发育过程中的表达分析

为了解蜕皮激素受体(EcR)在脊尾白虾卵巢和胚胎发育中的作用,采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾EcR基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC506600),用实时荧光定量PCR方法分析了EcR基因在雌虾不同组织、卵巢以及胚胎发育不同时期的表达特征。结果显示,脊尾白虾EcR基因全长2 638 bp,开放阅读框1 713 bp,编码570个氨基酸,脊尾白虾EcR在系统进化上与行抱卵繁殖的真虾类和蟹类亲缘关系较近,而与对虾类较远。脊尾白虾EcR基因在各组织中均有表达,但主要在肝胰腺内表达。在脊尾白虾繁殖期内,肝胰腺内EcR的表达量始终高于卵巢,表达量峰值出现在卵巢成熟时期,而卵巢内EcR的表达量在卵巢成熟前期达到最大,两种组织中EcR表达量与卵黄蛋白原(Vg)质量浓度变化趋势相一致。随着胚胎发育,EcR表达量呈先上升后下降趋势,在原肠期达到最大,前溞状幼体期和溞状幼体Ⅰ期的表达量虽有下降,但仍保持较高水平。结果表明,脊尾白虾EcR基因系统进化方向与虾蟹类不同繁殖方式相吻合,其mRNA主要在肝胰腺内表达;卵巢发育过程中,EcR基因参与了肝胰腺和卵巢中Vg合成,其在肝胰腺中表达量变化与性腺发育指数变化趋势一致,对卵巢成熟有重要作用;在胚胎发育过程中,EcR基因参与了胚胎细胞分化及器官形成。     

脊尾白虾甘露糖结合凝集素(MBL)基因在抗镉胁迫中的生物学功能分析

为研究Cd2+胁迫下脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)甘露糖集合凝集素(MBL)在肝胰腺中表达量的变化特征,本研究利用重金属镉(Cd2+)对脊尾白虾进行96 h急性毒性实验。实验共设置5组Cd2+浓度胁迫(0、0.01、0.0175、0.021和0.0278 mmol/L),分别在Cd2+胁迫后0、3、6、12、24、48、72和96 h共8个时间点取样。实时荧光定量结果显示,高浓度Cd2+(0.0175、0.021和0.0278 mmol/L)胁迫下,脊尾白虾MBL基因的表达量先呈上升趋势,在72 h达到峰值后随后下降,但各时间点表达量均与对照组存在显著性差异(P<0.01);Cd2+浓度为0.01 mmol/L时,脊尾白虾MBL基因的表达量整体呈下降趋势。进一步采用RNA技术干扰该基因表达后,发现Cd2+胁迫后的脊尾白虾个体死亡率显著增加。本研究表明,脊尾白虾MBL在应答Cd2+胁迫过程中可对机体起到一定的保护作用。     

脊尾白虾血蓝蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

应用RACE技术克隆了脊尾白虾血蓝蛋白基因全长cDNA序列,并对该序列进行了分析.结果显示,该基因全长2 158 bp,开放式阅读框长1 992 bp,5’非编码区长26 bp,3’非编码区长140 bp,将该基因命名为EcHc.EcHc编码663个氨基酸,前15个氨基酸组成信号肽,推测成熟肽的分子量为75.05kDa.Blast比对结果显示,由脊尾白虾血蓝蛋白cDNA序列推导的氨基酸序列与日本沼虾、信号小龙虾血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别为86％、68％,由此推断该cDNA序列可能属于血蓝蛋白家族.利用Real-time PCR方法,分别研究了鳗孤菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染脊尾白虾后,肝胰腺组织中EcHc基因在不同时间点的表达变化.实验结果表明,细菌或病毒感染后,EcHc基因在肝胰腺组织中的表达量显著增加,且均在感染后6h达到最高值,揭示脊尾白虾血蓝蛋白基因EcHc在脊尾白虾的免疫防御中具有重要作用.     

不同投喂频率对脊尾白虾生物钟基因表达、生长及肌肉成分组成的影响

为探究不同投喂频率对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)生长的影响, 确定脊尾白虾养殖适宜投喂频率, 本研究分析了在不同投喂频率下脊尾白虾眼柄和肝脏中的生物钟基因表达节律变化, 评估了不同投喂频率对脊尾白虾生物钟系统同步性的影响, 并开展了生长及肌肉组成的同步养殖验证。结果表明: 在投喂频率为＜3 次/d 时, 生物钟基因的表达节律并没有随着投喂频率的改变而发生变化, 无论在眼柄或肝脏中均表现出相似的表达周期及表达顶相, 且各自的表达量间也无显著性差异变化。然而, 当投喂频率增加到 4 次/d 时, 肝脏中部分生物钟基因的表达节律发生了显著变化, 表现为表达周期改变、相位明显偏移及表达量变化。其中, 投喂频率为 3 次/d 时, 脊尾白虾眼柄与肝脏中生物钟基因表达节律的同步性最高。生长结果也显示, 脊尾白虾的生长性能随投喂频率升高(从 1 次/d 至 3 次/d 时)而升高, 3 次/d 时达到最高, 其特定生长率及增重率分别为(6.65±0.98)%/d 和(199.46±5.42)%。同时, 随着投喂频率升高, 脊尾白虾肌肉组织中的粗蛋白及粗脂肪含量也呈现上升趋势, 在 3 次/d 时达到最高, 分别为(19.98±0.04)%和(1.88±0.23)%。投喂频率对脊尾白虾肝脏中生物钟基因的表达节律有重要影响, 表明该因素对重置或调控脊尾白虾外周生物钟系统有一定的牵引作用。     

脊尾白虾VgR基因克隆及其在卵巢发育过程中的表达分析

为了解卵黄蛋白原受体(vitellogenin receptor,Vg R)在脊尾白虾卵巢发育中的作用,采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾Vg R基因全长c DNA序列,用实时荧光定量PCR方法分析了Vg R基因在雌虾不同组织、卵巢发育不同时期的表达特征。结果显示,脊尾白虾Vg R基因全长5892 bp,开放阅读框5661 bp,编码1886个氨基酸。脊尾白虾Vg R具有低密度脂蛋白受体(LDLR)家族典型结构特征,属于LDLR家族,进化上与日本沼虾等甲壳动物Vg R亲缘关系最近,然后与昆虫Vg R分支聚为一支,而与LDLR家族中其他成员亲缘关系较远。脊尾白虾Vg R在各组织中均有表达,但主要在卵巢内表达。随着卵巢的发育,卵巢Vg R表达量逐渐升高,在III期达到最大,与肝胰腺Vg表达量、血液Vg浓度变化趋势相一致;而在卵巢成熟时,卵巢Vg R表达量降到了最低,与肝胰腺Vg表达情况截然相反;排卵后的恢复期,血液中Vg浓度仍维持在较高水平,卵巢Vg R表达量又升至III期水平,同时卵巢Vg表达量也升至最高。由此可见,甲壳动物与昆虫Vg R起源于同一祖先,但在进化上已形成独立一支;脊尾白虾卵巢成熟前,卵巢主要通过Vg R介导作用摄取血液中Vg,以供卵巢快速成熟;卵巢成熟期,肝胰腺呈现补偿性合成Vg,以尽快恢复其营养储备功能;卵巢恢复期,卵巢通过Vg R介导摄入外源Vg和内源合成Vg两种途径,为卵巢二次发育提供营养物质。     

脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及其表达特征分析

本研究根据脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)转录组序列,采用cDNA末端快速扩增技术克隆获得了脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因(SHMT)。该基因cDNA全长为1855 bp,其中,开放阅读框为1407 bp,5?端非编码区为39 bp,3?端非编码区为409 bp,共编码468个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为152.55 kDa,理论等电点为4.90。同源性分析显示,脊尾白虾SHMT基因与甲壳类动物真宽水蚤(Eurytemora affinis)同源性最高,为96%。荧光定量分析结果显示,SHMT基因在脊尾白虾眼柄、胃、肝胰腺、心脏、鳃、肠、肌肉、腹索神经、皮下脂肪以及卵巢中均有表达,其中,卵巢表达量最高,心脏次之。不同浓度Cd2+胁迫结果显示,其在低浓度(0.0100、0.0175和0.021 mmol/L) Cd2+胁迫中的表达模式基本一致,呈先升高后下降再升高再下降的趋势;而在高浓度(0.0278 mmol/L) Cd2+胁迫中,该基因表达量很低,甚至不表达,说明高浓度Cd2+胁迫可以抑制该基因的表达,具体机制有待进一步研究。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) FAMeT基因在卵巢发育周期中的表达分析

为了研究法尼酸甲基转移酶(Farnesoic acid O-methyltransferase,FAMeT)在脊尾白虾卵巢发育中的作用,采用实时荧光定量PCR方法分析连续3次繁殖过程中卵巢不同发育时期(Ⅰ-Ⅴ期)大颚器、卵巢和肝胰腺中FAMeT基因的表达规律。结果显示,FAMeT基因在鳃、心脏、肌肉、肝胰腺、卵巢、大颚器等组织中均有稳定的表达,其中,在鳃和大颚器的表达量显著高于其他组织;在卵巢发育周期内,FAMeT基因在大颚器、卵巢、肝胰腺中的表达量变化趋势基本一致,从Ⅰ-Ⅳ期逐渐下降,到Ⅴ期时表达量上调;在每个卵巢发育时期,FAMeT基因在大颚器中表达量最高,约为卵巢中表达量的20–30倍。研究结果表明,大颚器是合成FAMeT的主要组织,脊尾白虾繁殖过程中FAMeT基因主要在卵巢发育前期表达,可以合成大量甲基法尼酯(Methylfarnesoate,MF),促进卵巢发育。     

Cloning of the <Emphasis Type="Italic">ANT</Emphasis> gene and its expression profiles at different developmental stages and post-molting times in the ridgetail white prawn <Emphasis Type="Italic">Exopalaemon carinicauda</Emphasis>

To investigate the roles of the ANT gene, which codes for adenine nucleotide translocase (ANT) during crustacean development, a full-length cDNA sequence of EcANT in the ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda, was cloned, and its expression profile was analyzed at different developmental stages and post-molting times. The EcANT gene (GenBank accession number: KP892663) contained an open reading frame of 924 bp encoding a 307 amino acid protein with a theoretical size of about 33.42 kDa and a predicted isoelectric point of 9.77. Tissue expression analysis revealed that EcANT was mainly expressed in muscle and its expression level tended to increase with the developmental stages. In addition, the expression level of EcANT after molting increased following the lengthening of post-molting time. Our results suggest that EcANT is an important gene related to the growth and development of E. carinicauda.     

脊尾白虾全人工繁育技术初步研究

脊尾白虾是我国沿海地区池塘养殖重要品种,但目前尚未实现全人工繁育,严重制约了产业进一步发展。选取野生脊尾白虾作为亲虾,经过越冬培育、促熟交尾、幼体孵化培育、仔虾选育等手段,进行了脊尾白虾全人工繁育技术研究。试验结果显示,在盐度31.3、水温18.1~26.2℃、pH 8.1条件下,室内越冬脊尾白虾亲虾可成功培养至性腺成熟,并交尾抱卵,平均抱卵率达70%,平均孵化率为61.02%。幼体最佳培育密度20尾/L,仔虾适宜养殖密度0.13~0.53尾/L,培育至2cm时存活率可达80%,继续培育3个月后发育至性成熟。一年可繁殖2~3代。在此基础上建立了脊尾白虾近交家系,现已培育至第6代,各家系繁殖力、生长速度和存活率均未出现近交衰退现象。本研究初步解决了脊尾白虾室内全人工繁育技术,并为试验动物培育奠定了良好的技术基础。     

生石灰对蟹虾围塘养殖的影响

通过对越冬和非越冬锯缘青蟹、脊尾白虾、弹涂鱼耐生石灰试验,证明青蟹有很强的耐生石灰能力,脊尾白虾有较强的耐生石灰能力。蟹虾围塘养殖在围塘清淤后对越冬青蟹进行生石灰消毒,养殖过程中定期用生石灰泼洒,并与对照塘做对比试验,以及大面积推广应用,结果表明:使用生石灰能使围塘锯缘青蟹、脊尾白虾发病率显著减少,成活率显著提高,生长明显加快,蜕壳时间相对集中,饵料系数明显降低,产量和效益显著提高。生石灰对围塘蟹虾健康生长有很大作用。     

Comparative study on nutrient composition and quality evaluation in a new variety and wild‐typed ridgetail white prawn (Exopalaemon carinicauda)

Kesuhong No. 1 with high concentration of astaxanthin was a newly approved aquaculture variety of ridgetail white prawn (Exopalaemon carinicauda) in China, and the information on the nutrient composition and quality evaluation of this new variety is insufficient. Thus, the proximate composition, amino acid and fatty acid profiles were analysed and compared between the new variety and the wild‐typed prawn in the present study, for its better application of the new variety. It showed that there were no significant differences (p > 0.05) of the proximate composition, essential amino acid and saturated fatty acid (SFA) of muscle tissue between the wild‐typed prawn and the new variety. However, for the content of some delicious amino acids (Ala and Tyr), it was significantly higher (p < 0.05) than that in the wild‐typed prawn. Similarly, for some ω3 polyunsaturated fatty acids (ω3 PUFA), such as docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapntemacnioc acid (EPA), it was also significantly higher (p < 0.05) than that in the wild‐typed prawn. In addition, higher PUFA/SFA ratio and lower ω6/ω3 ratio also improved muscle quality in the new variety. Information obtained in the present study indicates a promising natural source of ω3 PUFA with high nutritional value, and has strong potential application value in this new variety of E. carinicauda.     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)回交家系遗传变异的微卫星分析

为解析脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)回交家系的遗传变异规律,本研究利用自行开发的25个微卫星标记对本实验室构建的A、B、C3个回交家系的遗传结构特征进行了分析.结果显示,回交家系A、B、C的平均等位基因数(Na)分别为2.21、2.18、2.09,观测杂合度(Ho)分别为0.3805、0.3703、0.2489,期望杂合度(He)分别为0.3629、0.3998、0.2503,多态信息含量(PIC)分别为0.3257、0.3391、0.2585,相较于野生群体与杂交家系已有了大幅度的降低,属中度或低度多态.回交家系A、B、C在25个位点共得到62个等位基因,其中,A家系56个,B家系54个,C家系51个,3个回交家系共同存在的等位基因为39个,6个位点在回交家系中已经纯合(其中,ECL10在A、B、C中都已纯合),计算得出3个回交家系的纯合率分别达到了53.86％、56.53％、63.33％.由此可见,回交家系的基因纯化速率较快,适用于脊尾白虾重要经济性状的遗传解析和优良种质的选育.     

Carbonic anhydrase and Na/K-ATPase activities at different molting stages of the giant freshwater prawn <Emphasis Type="Italic">Macrobrachium rosenbergii</Emphasis>

ABSTRACT:   In the present study, the role of carbonic anhydrase (CA) and Na/K-ATPase in the gill and epidermal tissues in the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii was examined as a function of molting stage. CA activity levels in the front and back gills were low at the intermolt stage C₀, but increased significantly at premolt stage D₃, and then decreased after molting. In the epidermal tissue, activity levels decreased gradually towards premolt to a minimum level at stage D₃, but became elevated at postmolt stages A and B. Na/K-ATPase levels in the front and back gills did not change significantly during the molt cycle. CA in the gill is possibly involved in supplying counter-ions for ion uptake, while CA in the epidermal tissue may play a role in mineralizing the exoskeleton after ecdysis. Na/K-ATPase in the gills may function in ion uptake from the ambient medium; however, since its activity was not influenced by the molt cycle, it probably does not have a major role in osmoregulation in the freshwater environment.     

Effect of nucleotide on growth, immune responses and resistance of Macrobrachium rosenbergii (De Man) to Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) and Aeromonas hydrophila infection

A 60-day feeding trial was conducted to evaluate the effect of dietary nucleotide on growth, survival, immunity and resistance to white muscle disease and Aeromonas hydrophila infection in freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii). The nucleotide was supplemented at 0, 1.5, 2.25 and 3.0 g/kg diet. The test diets were fed for 60 days in triplicate groups of prawns, which had initial weight of 0.27 g. At the end of the feeding trial, growth was recorded and non-specific immune parameters, such as, prophenol oxidase activity, superoxide anion production, total haemocyte count and total serum protein, were studied in haemolymph samples. Phenol oxidase activity and superoxide anion production were significantly (P < 0.05) higher in prawns fed nucleotide-based diets. Total haemocyte count and haemolymph were higher (P < 0.05) in prawns fed nucleotide-based diets. The relative per cent survival of prawn after the challenge test against white muscle disease was significantly (P < 0.05) higher in prawn fed nucleotide-incorporated diets. However, there was no effect of nucleotide supplementation on growth and survival of prawn.     

pH对日本沼虾存活及肝功能相关酶活性的影响

为揭示日本沼虾(Macrobrachium nipponense)对水体pH的适应性,分析了不同pH胁迫下日本沼虾在不同时段的存活率以及96 h后蜕壳率,免疫、肝功能相关酶活性的变化。结果显示,pH胁迫处理96 h时,不同pH处理组日本沼虾的存活率显著低于对照组,除pH 7.0组的蜕壳率与对照组差异不显著外,其余pH处理组蜕壳率显著高于对照组;暴露在弱酸性水(pH 6.0)、弱碱性水(pH 8.0)、碱性水(PH9.0)中的成活率不同,其中PH6.0组虾的成活率在36 h时显著低于PH8.0组,24 h时显著低于pH 9.0组;pH 5.0酸性处理组日本沼虾在试验期间存活率始终最低,上述结果表明日本沼虾对碱性水体的适应性强于酸性水体。比较不同pH值对日本沼虾肝功能相关酶活性的影响程度时发现,日本沼虾T-SOD、ACP、GOT、T-AOC酶的耐受pH生态幅较窄,AKP酶的耐受pH生态幅较宽。通过96 h的pH值与相关酶回归分析得出,日本沼虾的最适pH值范围为7.3~7.6。     

蜕壳周期内中华绒螯蟹钙含量、组织结构及相关基因表达变化

运用生化分析、组织切片和分子生物学等技术,测定蜕壳期(蜕下旧壳后0.5 h内)和蜕壳后期(蜕下旧壳0.5 h后至新壳未完全硬化之前)平均体质量(5.63±2.35)g中华绒螯蟹肝胰腺和鳃中的钙含量,观察肝胰腺和鳃组织结构变化,用荧光定量PCR技术分析肝胰腺和鳃中的钙网蛋白(CRT)基因的表达情况.试验结果表明,蜕壳后期...