企鹅源禽1型副黏病毒基因组序列分析

为了从分子水平上探讨企鹅源禽1型副黏病毒BP01的演化,根据GenBank登录的鹅源禽1型副黏病毒基因序列设计引物,运用RT-PCR方法于国内外首次测定了企鹅源禽1型副黏病毒全基因组序列,其全长为15 192nt.经分析表明BP01病毒基因组与SF02株和ZJ1株等鹅源禽1型副黏病毒同源性最高,分别为99.1%和99.0%;与IT-227/82和dove/Italy/2736/00等鸽源禽1型副黏病毒同源性分别为90.2%和88.1%;而与Hert/33和LaSota等鸡源禽1型副黏病毒的同源性最低,仅分别为87.9%/和83.2%.对F基因第47～435nt进行系统进化树分析和F基因第334～1 682 nt进行HinfⅠ、BstO Ⅰ、Rsa Ⅰ酶切位点分析,确定BP01株病毒为基因Ⅶ型.F蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合禽1型副黏病毒强毒株的特性,经预测发现BP01株病毒F蛋白的七肽重复序列分剐在第143～189位氨基酸残基和第461～503位氨基酸.通过对主要毒力基因推导的氨基酸序列进行比较发现,水禽源与其它源F蛋白有14个氨基酸不同,HN蛋白上有2个氨基酸的不同,而P蛋白有20个氨基酸的不同,且在第151～166位氨基酸存在一个明显的突变域.     

广东鸽禽Ⅰ型副黏病毒基因Ⅶ型的分离鉴定

2007年在广东某发病鸽群中分离到一株鸽禽Ⅰ型副黏病毒（GM01）．经测定,其鸡胚平均死亡时间（MDT）为76h,鸡脑内接种致病指数（ICPI）为1．3,在鸡和鸡胚上为中等毒力病毒。应用RT—PCR对F基因片段进行扩增并测序,结果表明该F蛋白裂解位点处氨基酸序列为112R—R—Q—K—R—F 117,是典型的强毒株序列。用DNASTAR软件对GM01株F基因片段与国内外相关的NDV参考株进行比较,结果表明GM01株与Chicken／Gx／14／2005株的核苷酸和氨基酸相似性分别为98．6％和98．4％;与Pigeon-Gxp40毒株核苷酸和氨基酸相似性分别为98．5％和98．7％,在遗传进化树中位于同一个分支,同属于基因Ⅶ型;与国内代表性弱毒疫苗株LaSota毒株和NDV强毒株F48E9的核苷酸及氨基酸相似性分别为84．1％和86．5％及86．3％和88．0％。     

鸭源禽副黏病毒1型YH_(99) V株的毒力测定和致病特性分析

从浙江省某麻鸭养殖基地的产蛋下降病鸭生殖器官内分离到1株致产蛋锐减、不致鸭死亡的病毒,经鉴定该病毒属于禽副黏病毒1型,命名为YH99V株。该毒株经动物回归试验能成功诱导鸭发病并回收同样的病毒,通过SPF鸡胚盲传至第9代时致病性突然增强,第11代出现血凝特性,第15代血凝价趋于稳定,鸡胚半数致死量EF15ELD50为10-4.8。MDT、ICPI和IVPI毒力学指标测定以及毒力相关基因序列结构分析表明,分离株的MDT为112h,ICPI为0.225,IVPI为0.41;YH99 V株F0蛋白裂解位点(112～117位)区域氨基酸推导序列为Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu,与弱毒株相一致。证明该毒株为新城疫弱毒株。     

鸽副黏病毒灭活疫苗候选株aYQ的生物学特性研究

评价鸽副黏病毒(PPMV)致弱毒株aYQ的生物学特性,为研制鸽副黏病毒灭活疫苗奠定基础。将PPMV aYQ株经SPF鸡胚连续传代,建立种子批。测定各代次毒种的血凝效价(HA)和鸡胚半数感染量(EID50),并进行纯净性检验;测定毒种鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI);测定毒种对鸡胚和鸽的毒力、遗传稳定性和抗原相关性。PPMV aYQ株经SPF鸡胚传代至F10,HA效价为1∶256～1∶512,病毒含量为10-8.5 EID50/0.1mL～10-8.9 EID50/0.1mL,毒种各代次均无细菌、霉菌、支原体以及外源病毒污染;PPMV aYQ株的ICPI和IVPI结果均为0,MDT测定结果大于120h;以103倍稀释的PPMV aYQ株病毒液接种10日龄SPF鸡胚96h无死亡,无眼观病变。以106EID50/羽的剂量人工感染鸽,未见异常症状;PPMV aYQ株各代次F基因均未发生基因突变,F蛋白裂解位点氨基酸序列均为-112GRQGRL 117-;交叉血凝抑制试验和交叉中和试验结果表明,PPMV aYQ株与NDV La Sota株间存在明显的抗原性差异。鸽副黏病毒弱毒株aYQ能够在SPF鸡胚上稳定传代,且生物学特性稳定,免疫原性良好,可以作为鸽源副黏病毒灭活疫苗的毒种。     

几株野生鸟类来源的Ⅰ型禽副粘病毒分子生物学特征的研究

参考GenBank中Ⅰ型禽副粘病毒（Avian paramyxovirus,APMV-1）序列,在F基因的3’端相对保守区设计1对引物,利用RT-PCR方法对华南农业大学兽医学院禽病学教研室近两年来从广州和深圳两个地区分离的4种动物来源共10株Ⅰ型禽副粘病毒毒株的F基因进行扩增,其扩增长度约为450bp。测序结果表明：广州株与NDV的基因Ⅵ型有高度的同源性,1个深圳株与Ⅶ型有较高的同源性,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112-117）强毒株的氨基酸序列特征;其他4个深圳株均与基因Ⅰ型有很高的同源性,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112-117）弱毒株的氨基酸序列特征。     

雏番鸭基因IX型禽1型副黏病毒分离鉴定及F基因序列分析

自发病死亡雏番鸭中分离到一株(XBT14株)基因Ⅸ型禽1型副黏病毒,该病毒可引起雏鸭明显神经症状及急性死亡,致死率达44.4%;病毒融合(F)蛋白裂解位点处具有强毒株特有的多碱性氨基酸序列(112RRQRR↓F117),与Gen Bank数据库中已发布的基因IX型毒株核苷酸序列同源性高达99.7%~99.9%,与基因VII型毒株核苷酸序列同源性为85.5%~86.6%。该分离株与近来报道的GD09-2等基因IX型毒株处于同一进化分支。以上结果表明对水禽致死性的禽1型副黏病毒呈现基因型多样性,水禽禽1型副黏病毒病的防控日益严峻。     

5株鸡源新城疫病毒F基因特性分析

为调查山西省鸡源新城疫病毒(NDV)的流行现状,2012—2013年从山西省部分地区的发病鸡群分离、鉴定出5株NDV,并对这5株NDV的分子生物学特性进行了研究。对各分离株F基因序列的分析表明:其中的4株病毒在基因型分类上属于基因Ⅱ亚型,并与标准弱毒疫苗La Sota株高度同源,为99.2%⁹9.4%。氨基酸序列同源性为100%,且裂解位点氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,符合弱毒株裂解位点特征。另一分离毒株在基因型分类上与JS/5/01/Go同属基因Ⅶd亚型,两者基因序列同源性为95.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。其裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,为强毒株裂解位点特征。     

不同禽源新城疫病毒的分离鉴定及其雏鸡感染试验

对来自吉林地区疑似新城疫感染死亡的不同禽源(鸡、鸭、鹅、鸽)病料进行病毒的分离鉴定,分析其主要基因序列,测定其毒力及对雏鸡的致病性。结果表明,分离出的4株病毒均为新城疫病毒(NDV),F蛋白裂解位点处序列均为112 R-R-Q-K-R-F117,与典型强毒株一致,且相互之间的同源性为98.4%~99.8%,均属Ⅱ类Ⅶd型新城疫强毒。毒力测定和对雏鸡的致病性试验,亦证明这4株NDV分离株为强毒株,且毒力差异不显著。由此推测,近年来吉林省流行的NDV以Ⅱ类Ⅶd型为主。短期内,NDV在不同禽源宿主间的种间传播对病毒的毒力和变异没有造成较大的影响。     

鸡新城疫病毒的分离与鉴定

应用鸡胚接种技术从南宁市郊区一个疑似发生新城疫鸡群采集的样品中分离到一株病毒,经对分离毒株进行血凝试验、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定,结果表明分离的毒株为新城疫病毒;对分离株进行毒力测定、致病性试验及对包含裂解位点的F基因部分片段的序列进行测定与遗传进化分析。结果表明,毒株对鸡胚平均致死时间为62.6 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.56,30日龄易感鸡攻毒后2 d开始出现明显的临床症状,攻毒后5 d内全部死亡,表明该分离株属新城疫强毒株,F基因裂解位点氨基酸基为112RRRKRF117,F基因遗传进化分析发现该毒株属于基因Ⅶ型,与同年从广西发病的白鹭分离的新城疫毒株亲缘关系较近。     

河南省某蛋鸡场新城疫病毒ZK1/18毒株的分离鉴定

对河南省某蛋鸡场病死鸡中分离的一株鸡源新城疫病毒(NDV)进行血凝性、鸡胚平均致死时间(MDT)、F基因测序和遗传进化分析。结果显示,该分离株HA效价平均为1:128,HI效价为1:1024,MDT为55h。F基因测序表明:其编码区长度为1662bp,共编码553个氨基酸;F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具有典型的NDV强毒分子特征,表明该分离株为强毒株,将其命名为A/Chicken/China/zhoukou1/18(简称ZK1/18)。遗传进化分析表明,该分离株属于Ⅶ型,是引起河南省新城疫疫情的主导基因型。该疫情提示,属于基因II型的LaSota疫苗株不能完全抵御基因Ⅶ型野毒的侵袭,在鸡群抵抗力降低时,可造成鸡群感染发病,需要加强综合防控。     

免疫鸭体内副黏病毒的分离及其F基因的分子特征

为分析当地鸭副黏病毒流行状况及其融合蛋白(F)基因的序列特征,从江苏省某新城疫疫苗免疫过的鸭群中分离到1株病毒,经血清学试验和中和试验鉴定为鸭副黏病毒,命名为JS0920株.生物学特性分析,9日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5.3；9日龄SPF鸡胚的最小致死量平均死亡时间(MDT)为47.7h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.875,6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定为2.7.用该病毒的培养物(鸡胚尿囊液)经肌肉注射攻毒,鸭的发病率为70％,死亡率为40％；鸡的发病率和死亡率均为100％.用RT-PCR方法扩增该分离毒株的F基因,序列分析表明,JS0920株与标准强毒株F48E9的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高,分别为99.2％和99.5％,与免疫预防用的LaSota株的同源性分别为89.0％和92.2％；其多肽裂解位点为112R-R-Q-R-R-F117,具有高致病性鸭副黏病毒毒株的分子特征；系统发育进化树分析,JS0920株与LaSota株的基因型不同,JS0920株为基因Ⅸ型,与F48E9株的亲缘关系最近.试验结果对认识当前DPMV的流行和变异现状以及疫苗研制具有重要的参考价值.     

一株鸵鸟胚源新城疫病毒生物学特征和遗传发生分析

从死亡的鸵鸟胚胎中分离到1株新城疫病毒毒株,经毒力检测为强毒株,鸡胚平均死亡时间为45h,IVPI为2.90,IPCI为1.88.RT-PCR扩增出融合蛋白(F)基因,测定核苷酸序列并进行遗传发生分析和酶切位点分析.对基因编码的氨基酸序列进行了推导,该毒株的蛋白酶裂解激活位点附近的氨基酸序列为112R(K)RQKR↓F117,为强毒特征序列,然而该毒株并未引起该鸵鸟群发病.根据绘制的系统进化发生树和F基因上3种限制性内切酶(RE)位点分布,确定该毒株均为基因Ⅶ型.该病毒与在我国鸡群、鹅群同期流行的毒株有很高的同源性.     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的分离及基因组分析

本研究从2008山东表现神经症状的某新城疫疫苗免疫鸡群中分离到一株病毒。通过鸡红细胞凝集试验和血凝抑制试验,表明为新城疫病毒,将其命名为ck/CH/LSD/08-29。根据GenBank上登录的新城疫病毒基因组序列,设计14对引物经过RT-PCR扩增病毒感染的尿囊液,同时应用3'-RACE和5'-RACE技术,扩增得到该病毒全部基因组序列。结果表明,该毒株基因组由15186个核苷酸序列组成,编码6种结构蛋白,在RNA上的顺序依次为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'。F基因裂解位点处的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列特点。通过F基因裂解位点附近高变区389个核苷酸序列构建遗传进化树,证明该毒株在分类地位上属于基因Ⅱ型。此外,病毒感染SPF鸡试验证明ck/CH/LSD/08-29毒株属于强毒嗜神经型毒株,能引起SPF鸡高致死率。     

鹅源新城疫病毒的分离鉴定及其致病性

从吉林省某发病鹅场分离到1株病毒,经血凝、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定证实,该毒株为新城疫病毒,命名为MHK-1株.毒力测定结果表明,该病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)为43 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.63,鸡胚半数致死量(ELD50)为10-8.3/0.2 mL,表明该毒株为新城疫病毒强毒株.经致病性试验表明,该病毒对鹅有很强的致病性.分子病毒学分析表明,MHK-1株F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列特点.     

一株新的鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒的分离鉴定

从进口鸽中分离到1株鸽Ⅰ型副黏病毒，经测定，其鸡胚平均死亡时间（MDT）为59．2h，鸡脑内接种致病指数（ICPI）为1．92，属于速发型新城疫病毒。通过RT—PCR，扩增出了该分离毒株F基因的重要功能区片段，经测序分析，其裂解位点的氨基酸序列为112RRQKR^117，符合新城疫强毒裂解位点特征。用blastn和blastx分别搜索GenBank的核酸和蛋白数据库，发现它与2株鸽Ⅰ型副黏病毒具有99％的同源性，系统发育进化树分析为基因Ⅵ型。表明，该病毒为1株新的强毒力鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒。     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的检测及HN、F基因序列分析

为了掌握辽宁省新城疫病毒(NDV)的分布特点,试验采用新城疫荧光RT-PCR方法检测到1株新城疫病毒,通过接种鸡胚分离鉴定后将其命名为CK/YK1/2013,通过PCR扩增得到HN、F基因全长片段并测定了基因序列。结果表明:该毒株可以使接种鸡胚在38 h内死亡,具备强毒株的生物学特性。CK/YK1/2013的F基因在裂解位点的氨基酸序列为111GGRQGRL117,与弱毒株LaSota序列相同,与其他已知强毒株的裂解位点不同。CK/YK1/2013的HN、F基因与Ⅱ型LaSota毒株的同源性为99.6%,与F48E9及Ⅶ型的同源性分别为89.1%和83.0%,基因进化树分析表明该毒株属于Ⅱ型NDV。     

鸡新城疫病毒新疆分离株F基因遗传进化分析

对2株分离自新疆乌鲁木齐市的鸡源新城疫病毒F基因进行了扩增、序列测定和分析.结果显示,该2株新城疫病毒F基因核苷酸序列长度分别为1586 bp和1654 bp,分别编码520和545个氨基酸；氨基酸裂解位点的序列均为112R-R-Q-K-R-F117,具备了基因Ⅶ型强毒株的特征；同源性分析表明,该2株新城疫病毒分离株与...     

鹅源副黏病毒致弱株的“拯救”及分子生物学鉴定

以本课题组前期构建的鹅源副黏病毒NA-1株的全长感染性克隆为模板设计2对引物,用overlap PCR方法将其F蛋白裂解位点处的112、115和117位碱性氨基酸定点突变成为具有典型弱毒株特征的非碱性氨基酸。随后将突变后的F基因序列替换全长感染性克隆的对应序列,构建突变后的克隆质粒FL-cDNA-F′。将改造后的感染性克隆质粒与pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助表达质粒共转染VT7细胞系,成功拯救出了致弱的鹅源副黏病毒。经过分子生物学鉴定,该毒株F基因序列具有典型的弱毒株特征。救获病毒的鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)为96h,表明救获的病毒毒力已被成功致弱,可以作为当前流行的鹅副黏病毒病的一个较为理想的疫苗候选株。     

两种禽源新城疫病毒分离株F基因遗传变异分析

以鸡胚分离结合血清学鉴定,从近几年江苏省及河南省分离到来自鸡和鸽子的6株新城疫病毒(NDV).病毒蚀斑纯化后,选取3个克隆利用RT-PCR技术扩增F基因重要功能区片段,在对PCR产物直接序列测定分析基础上,选取一致克隆株进行全长F基因克隆、序列测定分析.根据分离株序列与GenBank中NDV相关毒株序列比较分析,结果表明,所分离的6个分离株归属为3个NDV基因型,其中有基因VIId亚型(3株)、基因VI型(2株)和基因Ⅱ型(1株).这6株NDV的F蛋白裂解位点的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,属于NDV强毒株典型序列.     

鸽源新城疫病毒辽宁分离株LNPPMV17全基因测序与遗传演化分析

为了研究鸽源禽Ⅰ型副黏病毒辽宁分离株的遗传变异情况及分子生物学特征。根据GenBank公布的鸽源禽Ⅰ型副黏病毒Pi/SH/CH/0168/2013毒株设计16对引物,对辽宁分离株全基因分段进行扩增并测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,然后进行序列的比对分析。结果表明:辽宁分离株基因全长15 192 nt,并命名为LNPPMV17。F0裂解位点的氨基酸序列为~(112)R-R-Q-K-R-F~(117),结合F蛋白全基因遗传进化分析,辽宁分离株属于ClassⅡ基因Ⅵ型;并发现鸽副黏病毒M蛋白第36和68位点氨基酸与其他禽类副黏病毒有明显不同,这种差异可以作为区别其他禽类Ⅰ型副黏病毒的标志;全基因序列分析结果表明国内鸽源禽Ⅰ型副黏病毒的同源性较高,这可能是近年来赛鸽业迅速发展,鸽子流通增加,交叉感染所致。