螺旋粉虱的分子检测方法

螺旋粉虱(Aleurodicus dispersus)是一种世界性重要入侵害虫。针对其体型微小难以进行准确、快速鉴别,以及对其卵、若虫及不完整标本更是难以鉴别的难题,本文研究了它的分子标记快速检测方法。利用螺旋粉虱的CO I基因序列设计1对特异性引物,其扩增片段为399 bp。结果表明:此引物只对螺旋粉虱CO I基因具有特异性扩增,而对其他粉虱类昆虫不具有特异性扩增条带;该引物不仅能快速准确检测成虫,而且对其他虫态(卵、若虫和拟蛹等)亦具有同样的检测能力;同时,此检测方法灵敏度高,对成虫的检测限达到1/4000头。该检测方法的建立,为有效防控螺旋粉虱在我国的进一步扩散蔓延和危害提供了技术保障。     

台湾发现螺旋粉虱

螺旋粉虱曾于1988年发现于高雄县大寮乡,但当时为害较轻,未予注意。1989年11月在凤山分所番石榴园再度发现此虫。1989年12月该虫仅分布于高雄县凤山、大寮、林园,屏东县新园、东港及高雄市等地。次年12月高雄县沿海各乡镇,屏东县长治、麟洛、新埤及台南市等地都有发生,到1991年11月其蔓延北至台南县善化、七股,南至屏东县枫港,东至台东市,有逐渐扩散之趋势。     

SCAR分子标记鉴别烟粉虱和温室白粉虱

在简单重复序列PCR的基础上建立了烟粉虱和白粉虱两个物种DNA特异性片段的SCAR标记。验证表明,新建立的烟粉虱SCAR标记能特异性扩增不同地理种群的烟粉虱而不能扩增温室白粉虱;相反新建立的温室白粉虱SCAR标记则能特异性地扩增不同地理种群的温室白粉虱而不能扩增烟粉虱种群。两种SCAR标记能够快速、准确地鉴定烟粉虱和温室白粉虱。     

警惕螺旋粉虱传入中国

自从我国实行改革开放的政策以来,地膜、塑料大棚以及温室等保护地大面积推广,使得我国的蔬菜及花卉的生产和耕作方式发生了根本性的变化。最近几年,一些外来害虫,如美洲斑潜蝇Ｌｉｒｉｏｍｙｚａｓａｔｉｖａ、南美斑潜蝇Ｌｉｒｉｏｍｙｚａｈｕｉｄｏｂｒｅｎｓｉｓ...     

螺旋粉虱成虫的复眼形态及其内部结构

采用扫描电镜和组织切片法,观察了螺旋粉虱Aleurodicus dispersus Russell成虫复眼的形态及其显微结构。结果表明,螺旋粉虱复眼半球状,呈∞形分布于头部两侧,单个复眼约由253个小眼组成;各小眼面微凸,复眼中心区域小眼多为规则的六边形,密集排列似蜂窝状;近背区边缘小眼多为五边形或近圆形,小眼排列疏松,且少量相邻小眼的间距较大。雌、雄复眼小眼面积约为85μm2。单个小眼由角膜、晶体、网膜细胞及其特化产生的视杆和基细胞等几部分组成。晶体有四个晶锥细胞构成,晶体、视杆周围和色素细胞内均含有大量的色素颗粒。螺旋粉虱的复眼属于并置复眼。光、暗条件下,小眼的色素颗粒分布有所不同。光适应条件下,色素颗粒较均匀地分布于视杆上下两侧;暗适应状态下,色素颗粒则主要分布在视杆上侧和晶体下侧。而在相同的明、暗适应条件下,性别对色素颗粒的分布无显著影响。     

螺旋粉虱成虫对高效氯氰菊酯的抗性监测

2009年6月至2010年12月期间,系统监测了海南省琼海市、三亚市、陵水县、儋州市、文昌市、琼中县、昌江县的螺旋粉虱成虫田间种群对高效氯氰菊酯的抗药性水平,结果表明:7个监测地区的螺旋粉虱成虫田间种群对该药剂的抗性均处于低水平敏感阶段,且各监测地区间无明显抗性差异,初步明确螺旋粉虱自2006年在海南省被发现以来,并未对该药剂产生高水平的抗性;以LC50值为指标,该药剂对7个地区螺旋粉虱田间种群的室内相对毒力水平基本一致。     

Heterodera filipjevi许昌群体SCAR标记的建立

菲利普孢囊线虫Heterodera filipjevi是禾谷类作物上重要的病原线虫之一,严重影响禾谷类作物的产量和品质。本课题组前期研究发现菲利普孢囊线虫许昌群体是一个新的致病型,其在小麦上的致病力强于其他多个群体,危害更为严重。本研究旨在建立菲利普孢囊线虫许昌群体的快速、准确的分子检测体系,为Heterodera filipjevi许昌群体的监测和防控及抗病品种的选育利用奠定基础。本研究采用随机扩增多态性DNA(RAPD)和序列特征扩增区域(SCAR)的方法,对黄淮麦区5个重要小麦孢囊线虫致病型共9个线虫群体进行RAPD分析和SCAR标记转化,并通过增加除黄淮麦区外的线虫群体验证所获得的致病型相关分子标记的特异性和有效性。本研究共筛选了331条RAPD引物,筛选出2个菲利普孢囊线虫许昌群体相关的RAPD标记,引物S86可以扩增出1条约550 bp的多态性片段,引物S178可以扩增出1条约1 200 bp的多态性片段,并将这2个RAPD标记成功转化为SCAR标记。SCAR标记的特异性检测结果表明这两个SCAR标记只在许昌群体上有特异性扩增,可以用于许昌群体的分子检测。     

小麦条锈菌水源11类群的RAPD分析及SCAR标记的建立

鉴于水源11类群近年来一直处于优势地位,为简化其检测手段,本研究利用RAPD技术对该类群的8个主要致病类型进行了多态性分析,以寻找其中主要流行类型的特异性分子标记。结果如下:共筛选出10个碱基随机引物190条,其中94条可得到稳定清晰的扩增图谱,用该94条引物进行RAPD分析,发现各致病类型间遗传变异丰富;以引物S1410扩增得到了水源11-4的特异性DNA条带;以引物S1412和S1304扩增得到了水源11-14的特异性DNA条带;对引物S1304扩增得到的特异性DNA条带回收、克隆和测序,设计了1对19bp/18bp的引物,并成功地将其转化为对水源11-14特异的SCAR标记。以上结果表明,通过规模筛选来寻找小麦条锈菌生理小种的特异性DNA片段,并将其转化为稳定的SCAR标记,有可能建立起中国小麦条锈菌流行生理小种的快速分子鉴定体系。     

螺旋粉虱在中国的适生区预测与风险区划

螺旋粉虱Aleurodicus dispersus Russell是新入侵中国海南的危险性害虫.根据制约螺旋粉虱分布的关键气候因子临界值、有效积温和生物气候相似距,选用Access设计数据库、Maplnfo MapX和Visual Basic设计程序,构建螺旋粉虱地理分布模型(geographic distribution model for A.dispersus,GDMAD),并以我国670个气象站点30年的气象资料运行该模型.结果表明:螺旋粉虱在中国的适生区主要包括以广东、广西为中心的1个大区和以四川盆地为中心的1个小区.螺旋粉虱在上述适生区可以安全越冬,1年发生4～12代,以6～9代为主.其中,高度危险区主要包括台湾、海南、广东、广西的大部、福建东南部以及江西、云南的个别地区,面积约38.84万km2;危险区主要包括浙江南部、江西中南部、湖南南部、福建大部、广西北部、云南中南部、四川东南部、贵州南部以及广东、湖北、台湾的个别地区,面积约85.70万km2;轻度危险区主要包括四川、云南、贵州、湖南、江西、浙江等气温较低的部分地区和广东、海南、台湾等降水量过大的个别地区,面积约35.12万km2.     

57种南药植物粗提物对螺旋粉虱杀虫活性初步研究

测试了57种南药植物粗提物对螺旋粉虱成虫的杀虫活性.结果表明,在5 mg/mL浓度下,57种南药植物粗提物对螺旋粉虱成虫表现出较好的触杀活性.其中长春花、艾纳香、刺篱木、薄荷、广藿香、曼陀罗6种南药植物粗提物对成虫的触杀活性在60％以上,活性最好的是长春花粗提物,对成虫的触杀活性为67.3％.毒力测定结果表明:薄荷粗提物对成虫的EC50值最小,为3.308 9 mg/mL.因此薄荷对螺旋粉虱表现出较好的抑制活性,具有进一步研究开发的价值.     

稻曲病菌的SCAR标记及其PCR检测

为建立稻曲病菌Ustilaginoidea virens快速、灵敏的PCR早期检测技术,以S380为引物,对稻曲病菌和其它参试病原菌的DNA进行RAPD-PCR扩增。稻曲病菌RAPD特异片段经回收、克隆和测序后,根据序列用Primer 5.0软件设计了特异性SCAR引物US-SF（5’-TCGCCTCAGACCTCAATC-3’）/US-SR（5’-GAGCCTCAAATGCCTTCC-3’）和巢式PCR引物US-NF（5’-AGCGTCTCCTGCAACC-AC-3’）/US-NR（5’-GAGCCTCAAATGCCTTCC-3’）。利用引物US-SF/US-SR通过常规PCR对供试稻曲病菌均可扩增出1条大小约257 bp的清晰条带,对其它植物病原菌DNA的PCR产物均无扩增条带,最低可检测到1 pg/μL 的病菌基因组DNA;而利用引物US-SF/US-SR和US-NF/US-NR通过巢式PCR可从10 fg/μL的病菌基因组DNA中扩增出1条大小约210 bp的特异性条带。试验表明,巢式PCR检测灵敏度比常规PCR提高了100倍,且巢式PCR可从接菌的水稻幼颖和自然感染的谷粒中检测出稻曲病菌。     

小麦叶锈菌的特异性分子诊断检测技术

小麦叶锈病由Puccinia triticina引起,是我国小麦生产上的重要病害。本研究旨在建立小麦叶锈菌快速、准确的PCR诊断检测技术体系,用于病害精准测报和综合防控。以真菌β-微管蛋白基因的保守序列为引物,进行小麦锈菌gDNA的PCR比较分析,发现小麦叶锈菌具有长度为268bp的特异性DNA片段;序列分析后设计了2对专化性引物,成功获得检测灵敏度为5.00pg/μL模板DNA浓度水平的小麦叶锈菌种的特异性SCAR标记。对55个来自我国不同麦区的小麦叶锈菌标样以及其它麦类病原真菌的检测表明,该叶锈菌标记的检测可靠性达100%。人工接种条件下,叶锈菌侵染24h后,即可在小麦叶片内检测到该标记。     

小麦条锈菌新菌系V26的SCAR检测标记

 建立小麦条锈菌生理小种的快速分子检测技术体系对小麦条锈菌的监测和防治策略的制定具有重要价值。条锈菌V26是近年来出现的,对我国目前小麦抗病育种中普遍应用的抗条锈病基因Yr26具有毒性的新菌系。该菌系的出现,对我国当前小麦生产、抗病育种都造成了严重威胁。本研究选用189条随机引物对CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、T4、Su11-4和V26等7个条锈菌生理小种(菌系)进行了扩增,筛选V26的特异性RAPD片段,并对其进行克隆和测序。根据测序结果,设计并合成SCAR特异性引物, 将V26的RAPD标记转化为稳定的SCAR标记。使得对该菌系的快速检测成为可能,同时也将会为条锈菌新小种的监测提供更为准确的科学依据。     

利用双重PCR技术快速检测水稻细菌性谷枯病菌

根据水稻细菌性谷枯病ITS和gyrB基因,设计两对特异性PCR检测引物,建立了水稻细菌性谷枯病菌的双重PCR检测方法。用该方法对水稻细菌性谷枯病菌和其它植物源性细菌进行双重PCR扩增及灵敏度测试,并对采自不同地区的水稻样本进行水稻细菌性谷枯病菌的检测。结果显示,双重PCR方法能特异性地检测出8株水稻细菌性谷枯病菌,可从含水稻细菌性谷枯病菌浓度为102cfu/mL的菌液中检测出该病菌;采用该方法对我国不同地区的水稻材料进行检测,并未发现水稻细菌性谷枯病菌。     

椰心叶甲人工饲料的研制及应用效果评价

为了获得入侵害虫椰心叶甲Brontispa longissima(Gestro)的人工饲料,在分析其天然寄主叶片水分和营养成分基础上,借鉴其它鞘翅目昆虫人工饲料配方,进行椰心叶甲人工饲料的配制和筛选,并评价人工饲料饲养的椰心叶甲对其寄生蜂椰甲截脉姬小蜂Asecodes hispinarum和椰心叶甲啮小蜂Tetrastichus brontispae的适合性。人工饲料配方的成分:蔗糖4%、椰子粉2%、大豆粉2%、椰树叶粉10%、酵母2%、维生素E 0.3%、抗坏血酸0.2%、对羟基苯甲酸甲酯0.2%、琼脂4%、链霉素0.03%和水75%。用所配制的人工饲料饲养椰心叶甲初孵幼虫,其蛹成活率可达36%,蛹羽化率与对照无显著差异,均在90%以上;雌成虫占52.4%,与对照无显著差异。表明人工饲料饲养所得的椰心叶甲可用于其幼虫寄生蜂椰甲截脉姬小蜂和蛹寄生蜂椰心叶甲啮小蜂的扩繁。     

寄生Q型烟粉虱的丽蚜小蜂生长发育特性

为了阐明丽蚜小蜂Encarsia formosa对Q型烟粉虱的寄生特性及寄主植物携带病毒对其寄生的影响,采用微虫笼饲养法研究了寄生Q型烟粉虱的丽蚜小蜂生物学特性。结果显示,丽蚜小蜂寄生Q型烟粉虱3龄若虫时,其生长发育显著优于寄生Q型烟粉虱2龄若虫。丽蚜小蜂在感染黄化曲叶病毒（TYLCV）番茄和健康番茄上寄生Q型烟粉虱（分别为VW和NVW）3龄若虫时,其生长发育特性发生了明显变化。丽蚜小蜂以VW若虫为寄主时的寿命为10.25 d,显著长于寄生NVW的丽蚜小蜂寿命（5.90 d）;对VW和NVW后代3龄若虫的寄生率分别为23.81%和17.62%,致死率分别为38.95%和26.52%,差异均显著;而丽蚜小蜂的羽化率和发育历期不存在显著差异。说明丽蚜小蜂寄生Q型烟粉虱3龄若虫时更适宜其生长发育,寄主植物番茄携带TYLCV显著提高丽蚜小蜂对烟粉虱的寄生效果。     

李属植物检疫性丁香疫霉和栗黑水疫霉的三重PCR分子检测

为建立我国禁止进境的2种检疫性真菌丁香疫霉Phytophthora syringae和栗黑水疫霉P.cambivora的同步分子检测方法,根据疫霉属的18S rRNA、HSP90和Ypt1基因分别设计通用引物、丁香疫霉和栗黑水疫霉的特异性引物,建立三重PCR检测方法,并进行灵敏度测试和模拟带菌试验。结果表明,可同时检测李属植物上丁香疫霉和栗黑水疫霉的特异三重PCR检测体系为:最佳引物浓度组合18SUF/18SUR、PCSF/PCSR和PSSF/PSSR依次为0.2、0.8、1.0μL,最佳退火温度为63℃,最佳退火时间为20 s。该体系扩增丁香疫霉出现884 bp的18S rRNA条带和683 bp的HSP90基因特异条带,扩增栗黑水疫霉出现884 bp的18S rRNA条带和314 bp的Ypt1基因特异条带,对照菌只出现18S rRNA条带;三重PCR反应体系检测灵敏度低于单重PCR;模拟带菌试验可同时扩增出3个片段。表明该三重PCR检测方法能实现丁香疫霉和栗黑水疫霉的同步特异性检测,可有效改进李属类水果及其种苗上检疫性疫霉的快速检测。     

菜豆普通细菌性疫病菌在土壤和植株残体中的越冬能力

为评估菜豆普通细菌性疫病菌地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种或褐色黄单胞菌褐色亚种在土壤及植物残体中的越冬能力,对采自黑龙江、内蒙古、山西、河北及新疆的18块菜豆生产田的20份土壤及14份植物残体样品进行病原菌分离和鉴定。在MT选择性培养基上有12个土壤样品和13个植株残体样品提取液产生典型的类似黄单胞菌菌落。选取29个分离物进行致病性测定,有27个分离物对菜豆品种"英国红"致病。利用地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种和褐色黄单胞菌褐色亚种的特异性引物X4c/X4e及褐色黄单胞菌褐色亚种特异性引物Xf1/Xf2对29个分离物进行多重PCR检测,其中17个分离物为地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种,10个分离物为褐色黄单胞菌褐色亚种。结果表明,菜豆普通细菌性疫病菌可以在黑龙江、内蒙古、山西、河北的一些菜豆种植区的土壤及植株残体中越冬存活。     

短小芽胞杆菌DX01菌株Tn5转座突变株的抑菌活性筛选体系的建立

为建立短小芽胞杆菌Bacillus pumilus DX01菌株的Tn5转座突变株抑菌活性的高效筛选体系,采用发酵液平板抑菌法研究了各突变株发酵液对稻瘟病菌Magnaporthe grisea生长的影响,并测定了目标突变株的几丁质酶和蛋白酶活性及发酵液对稻瘟病菌分生孢子萌发的抑制率。从2 633个突变株中筛选出6个抑菌活性较对照菌株DX01显著变化的突变株。对照DX01发酵液对真菌孢子萌发的抑制率为36%,而突变株Tn5-901和Tn5-194则分别为96%和3%,抑菌活性与对照的差异达到极显著水平。其余4个突变株的几丁质酶、蛋白酶活性多重比较结果与发酵液平板抑菌结果并不完全一致,但发酵液平板抑菌法简单、高效,适用于短小芽胞杆菌突变株的抑菌活性初筛。