广西鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的东北白鹅α干扰素（IFN-α）基因（AY524422）序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR从经鹅副粘病毒（GPMV）刺激培养的鹅外周血淋巴细胞中克隆获得广西鹅IFN-α基因,将其连接pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞后进行序列分析.结果表明,广西鹅IFN-α基因完整的开放阅读框大小为576 bp,共编码192个氨基酸残基,其推导的氨基酸中有7个半胱氨酸残基和2个潜在的糖基化结合位点（NDT和NHT）.与GenBank上已公布的其他IFN-α基因进行同源性比较分析,发现广西鹅IFN-α基因与东北白鹅的同源性最高（核苷酸同源性为98.3%、氨基酸同源性为96.4%）,与鸡、牛、猪、鼠、犬、人等的同源性较低.说明IFN具有种属特异性,且亲缘关系越近同源性越高,这与物种之间的进化亲缘关系一致.     

麻鸭γ-干扰素基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术,直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出麻鸭γ-干扰素基因(duIFN-γ),并克隆、测序。测序结果表明,麻鸭IFN-γ全序列大小为515 bp,包含一个完整阅读框(495 bp),编码164个氨基酸残基,推导的氨基酸有3个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。麻鸭IFN-γ基因序列与AF087134、AF100929、AJ012254的序列完全一致,而与北京鸭(AY166850)核苷酸同源性为99.6%,有2个碱基差异,为非同义突变,氨基酸同源性为98.8%。麻鸭IFN-γ基因与鸡、火鸡和鹌鹑IFN-γ基因核苷酸序列同源性分别为77.2%、78.0%、78.8%,氨基酸序列同源性均67.1%,而与人、狒狒、猪、牛、绵羊、犬、猫IFN-γ核苷酸序列同源性为39.7%～42.1%,氨基酸序列同源性在28.0%～31.7%之间。     

3个品种鸡α干扰素基因的克隆与序列分析*

 根据GenBank中鸡α干扰素（IFN-α）基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基。3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9％。克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间。     

石歧杂鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据现有鸡γ－干扰素基因序列设计引物，应用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从Con A诱导培养的鸡脾淋巴细胞中扩增得到石岐杂鸡γ－干扰素（spzChIFN-γ)基因，将克隆到pGEM-T载体中，进行序列测定，结果表明，克隆得到的ChIFN-γ基因的开放阅读框架由492个核苷酸组成，和其他ChIFN-γ基因的同源性达99％，与火鸡γ－干扰素基因的同源性性为96％，与鸭γ－干扰素基因的同源性为81％，推导的石岐杂鸡IFN-γ氨基酸序列与其他已发表的ChIFN-γ氨基酸序列完全一致，与火鸡和鸭IFN－γ氨基酸同源性分别为97％和67％。     

鹅神经肽Y基因的克隆及生物信息学分析

克隆出鹅NPY基因并对序列进行分析。根据鸡NPY基因核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法获得了鹅NPY基因的编码序列,并用相关软件及在线分析方法对其核苷酸及氨基酸序列进行分析。结果表明,鹅NPY基因长度为371 bp,包含294 bp整个开放阅读框,共编码97个氨基酸,其分子量预测值为11.083 kD,等电点为(pI)为5.76。鹅NPY基因核苷酸序列与禽类和哺乳动物的序列同源性分别为96%~97%、86%~88%。氨基酸进化树分析发现NPY基因具有种间多样性,鹅NPY与其他禽类处于同一分支。成功克隆鹅NPY基因CDS序列并对其进行了生物信息学分析,为深入研究其功能奠定基础。     

3个品种鸡α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中鸡α干扰素(IFN-α)基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基.3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9%.克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间.     

中国大耳白肉兔IFN-γ、IL-2和IL-4基因的克隆测序与进化分析

实验应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,在国内首次从ConA诱导培养的中国大耳白肉兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到IFN-γ、IL-2和IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中,经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明:①经克隆得到的IFN-γ基因(序列号:DQ852341),与Genbank中已登录的欧洲兔IFN-γ基因(序列号:AB010386)的核苷酸序列和推知氨基酸序列的同源性均为100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在63.0%(鼠)～77.6%(人)之间;编码氨基酸同源性在41.7%(鼠)～65.7%(人)之间;②扩增得到的IL-2基因(序列号:DQ852342),与Genbank中已登录的欧洲兔IL-2基因(序列号:AF068057)的核苷酸序列和推知氨基酸序列的同源性分别为99.6%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在64.8%(鼠)～86.0%(人)之间;编码氨基酸同源性在55.7%(鼠)～80.1%(人)之间;③扩增得到的IL-4基因(序列号:DQ852343),与Genbank中已登录的欧洲兔IL-4基因(序列号:AF169169)的核苷酸序列和推知氨基酸序列同源性均为100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在57.0%(大熊猫)～69.8%(人)之间;编码氨基酸同源性在43.0%(鼠)～53.6%(人)之间。用这3个基因分别构建的进化树结果都表明,兔与人的亲缘关系相对较近,与鼠的亲缘关系最远,这与传统的分类地位基本吻合,即兔与鼠应分别归为兔形目和啮齿目动物。     

狸猫α-干扰素全基因的克隆及生物信息学分析

根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序。用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析。结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点。IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

京巴犬α-干扰素全基因的克隆与分子进化分析

根据基因库(CenBank)中收录的犬α-干扰素(IFN-α)基因核苷酸序列(AB102731),设计并合成了1对引物,PCR扩增京巴犬IFN-α全基因,并克隆、测序.结果表明,犬IFN-α基因全基因序列为564 bp,包含1个开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸.序列比较分析发现,京巴犬IFN-α基因序列与GenBank发表的其它品种犬IFN-α基因序列核苷酸同源性为96.3%以上,氨基酸同源性为94.1%以上,其中与AB102731核苷酸同源性最高,为99.5%.仅有3个碱基差异.京巴犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.京巴犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

犬γ-干扰素基因的克隆、序列分析及蛋白质结构预测

根据Gen Bank上犬γ-干扰素基因(IFN-γ)序列(序列号WO318193),利用Primer 5.0软件设计特异性引物,应用RT-PCR技术从100μg/ml Con A刺激24 h后的犬外周血淋巴细胞总RNA中扩增出γ-干扰素基因,测序后应用DNAStar软件对克隆的犬γ-干扰素基因进行序列分析,并与Gen Bank上发表的犬、牛、大熊猫、鸡、牦牛、人、猪、野猪、斑马鱼、土拨鼠等的IFN-γ基因序列进行同源性比较。结果显示,克隆的犬IFN-γ基因大小501 bp,编码166个氨基酸,与犬、牛、大熊猫、鸡、牦牛、人、猪、野猪、斑马鱼、土拨鼠IFN-γ基因的核苷酸序列同源性分别为98.4%、81.6%、26.1%、26.1%、22.7%、22.7%、80.8%、81.0%、28.5%和25.0%;氨基酸序列同源性分别为95.8%、72.5%、5.4%、5.4%、6.6%、6.6%、68.9%、69.5%、5.4%和5.4%。运用DNAstar软件对犬γ-干扰素进行蛋白结构预测的结果显示,犬γ-干扰素蛋白含有10个α-螺旋、9个β-折叠、11个β-转角和5个无规则卷曲。     

籽鹅催乳素基因的克隆及诱导表达条件的优化

运用RT-PCR方法,获得籽鹅脑垂体催乳素（Prolactin,PRL）基因编码区序列cDNA,克隆到pMD18-T载体上。DNA序列分析表明,PRL cDNA全长690 bp,编码230个氨基酸残基,与皖西白鹅的碱基同源性达99.57%,氨基酸同源性达99.56%。将所得序列与表达载体pET-32 a（＋）构建表达质...     

火龙果Actin及UBQ内参基因片段的克隆及序列分析

为给火龙果的功能基因表达和调控研究提供内参基因,根据Actin基因和UBQ基因的保守区设计引物,采用RT-PCR方法克隆火龙果Actin基因和UBQ基因片段。结果表明:克隆的Actin基因和UBQ基因片段大小分别为302bp、192bp,分别编码100个氨基酸和63个氨基酸。Actin基因片段与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在78%以上,与氨基酸序列的同源性达88%以上;UBQ基因片段与其他植物UBQ基因核苷酸序列的同源性均在88%以上,与氨基酸序列的同源性达95%以上。     

中国猪瘟兔化弱毒（C-株）兔脾组织毒P80基因的序列分析

利用RT-PCR及Nest-PCR技术扩增出了C-株兔脾组织毒P80基因,将其克隆到PGEM-T载体中,测定了其核苷酸序列并推导出了氨基酸的序列。将C-株P80基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的HCV Alfort株、Brescia株、C株细胞（SK6）毒P80基因核苷酸及氨基酸序列进行比较,结果表明C-株P80基因与C株SK6细胞毒P80基因的同源性最高为99%,与Alfort株P80基因的同源性最低为87%;氨基酸同源性均在98%以上。表明了中国的C-株毒与荷兰所发表的C株毒的缘源关系,同时也证实了HCV P80基因的高度保守性。核苷酸序列分析表明,P80基因可编码丝氨酸类蛋白酶及RNA解旋酶。     

藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

亚洲猫β-干扰素基因的克隆与分析

[目的]为猫干扰素类生物制品的研究奠定基础。[方法]根据NCBI上的猫IFN-β基因序列,设计1对特异引物。以从病死猫肝脏组织中提取的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。将扩增产物回收后,与pUCm-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过PCR和双酶切对获得的质粒DNA进行鉴定后,进行序列分析和核苷酸、氨基酸序列同源性的比较。[结果]经PCR扩增,可获得一条561 bp的特异性条带。猫IFN-β基因已成功重组到载体中,获得阳性克隆。序列分析结果表明,亚洲猫IFN-β基因长561 bp,编码186个氨基酸,与已报道的猫IFN-β基因同源性达99.82%,而氨基酸序列未改变。[结论]该研究成功克隆了猫IFN-β基因,为进一步利用基因工程技术生产重组猫IFN-β基因及其生物学功能的研究奠定了基础。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株 YG97经 1 0日龄鸡胚增殖后纯化 ,提取病毒基因组 RNA,采用 RT-PCR一次性扩增出与预期设计的 1 .7kb大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入 p GEMR -T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒 F基因的阳性克隆 ,并进行了序列测定。序列分析表明 :扩增的 F基因片段的长度为 1 695bp,共编码553个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 R-R-Q-K-R-F1 1 7,与 NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性试验结果相符。同源性分析表明 :与国内标准强毒株 F48E9的核苷酸同源性为 86%,与国内外部分发表的其他 NDV毒株的核苷酸同源性在 84 %～ 89%之间 ,说明该毒株相对于经典的 NDV在 F基因上已发生了较大的变异     

5株猪O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取5株猪O型口蹄疫病菌（FMDV）（L1-L5）的RNA，用1对通用引物经RT-PCR法扩增了5株病毒VP1基因的DNA片段，克隆后通过测序获得其核苷酸序列，分析表明，除L2株外，其余4株（L1，L3，L4和L5）VP1基因的核苷酸序列同源性在96.7%-99.8%。氨基酸序列同源性在99.5%-100%；而L2株与L1，L3，L4和L5株VP1基因的核苷酸序列同源性在82.0%-83.4%，氨基酸序列同源性在89.7%-90.1%,L1,L3,L4和L5株病毒VP1基因的核苷酸序列与已经发表的GD/CHA/86，HKN/1/99，HKN/16/96的同源性较高，核苷酸序列同源性在85.0%-99.8%，属于同一基因型；而与L2，F29/CHINA及国外大多数毒株相比，属于不同的基因型，其核苷酸序列同源性仅为41.0%-82.6%，5株毒株中的L1，L3，L4和L5的主要中和抗原位点140-160，200-213位氨基酸序列完全相同，推测其有相近的中和单抗表位和相同的抗原性。     

禽呼肠孤病毒分离株σ2蛋白基因克隆及序列分析

为了解禽呼肠孤病毒（ARV）广西分离株与常用疫苗株在基因水平上的差异,将从广西某鸡场分离获得的2株ARV（R1、R2）分离株的σ2蛋白基因经RT-PCR扩增后,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经PCR、双酶切鉴定及序列分析。结果表明,2株ARV分离株的σ2蛋白基因已成功克隆到质粒载体上;经序列分析发现,2株ARV分离株与ARV标准株S1133的核苷酸同源性分别高达99.2%和99.3%,其推导的氨基酸同源性分别高达98.1%和98.4%;两分离株间的核苷酸同源性为99.7%,其推导的氨基酸同源性为98.5%,具有很高的同源性。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1株omp基因克隆及序列分析

根据Genbank中禽多杀性巴氏杆菌的omp（outer membrane protein）基因核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR方法扩增出禽多杀性巴氏杆菌（5∶A）C48-1株的omp基因全长片段,与克隆载体pmD18-T连接后,转化感受态细胞,对经PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的克隆进行测序。结果表明omp基因全长2 376bp,编码791个氨基酸。序列分析表明该菌株与PBA100株、P52株、EU570212、PM70株核苷酸同源性为48.7%～98.6%,氨基酸同源性为34.8%～99.0%。     

青鱼γ-干扰素基因的克隆与表达分析

【目的】开展青鱼γ-干扰素(IFN-γ)基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术获得了青鱼(Mylopharyngodon piceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列,然后根据其末端序列设计特异性引物,扩增得到青鱼IFN-γ基因cDNA全长序列,对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析,同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体,将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】青鱼IFN-γcDNA全长为895bp,其开放阅读框大小为549bp,编码182个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示,青鱼IFN-γ与人、鸡、鼠IFN-γ的序列相似性仅为1.5%~7.7%,与其他鱼类IFN-γ序列相似性较高,为16.3%~92.9%。青鱼IFN-γ分子N末端包含1个信号肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青鱼IFN-γ蛋白二级结构与高等脊椎动物IFN-γ类似,包含7个α螺旋结构。经Poly I:C诱导后发现,IFN-γ在青鱼头肾、肾、脾、皮肤和鳃组织中表达显著上调,最高的为头肾,其次为脾、皮肤、鳃和肾,而在心脏和脑组织中无显著变化。青鱼γ-干扰素真核表达质粒在青鱼鳍条组织细胞中成功表达IFN-γ。【结论】成功克隆了青鱼IFN-γ基因cDNA,经Poly I:C诱导后,该基因在头肾中上调倍数最为显著,青鱼γ-干扰素在体外获得表达。