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以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5’末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌B121中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc。GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测。结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应。OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础。 相似文献
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以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达栽体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APP OMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。 相似文献
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以国内主要流行的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)QH-1、HN-7菌株的基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增出外膜脂蛋白(OML)基因片段,然后将其克隆至pMD18-T载体中,经酶切和PCR鉴定,对阳性克隆进行序列测定。将测序结果分别与标准菌株进行比较,QH—1株的核苷酸序列与血清1、9、11、12型参考株的同源性达99.1%~99.9%;HN-7株的核苷酸序列与血清7、3、4、6型参考株的同源性达97.3%~100%,与其他血清型参考株的同源性较低。 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆及其原核表达 总被引:3,自引:0,他引:3
参照GenBank上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型菌株(AF363361)的apxⅠA基因序列设计了1对特异性引物,用PCR法扩增apxⅠA基因,获得了3069bp的片段,将其克隆到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列分析,表明克隆是成功的。再将长为1149bp的apxⅠA基因的部分片段(编码ApxⅠ的N-端的片段)插入到原核表达载体pET-28(a)中,构建了重组表达质粒pET—apxⅠA,转化大肠埃希氏菌JM109(DE3),在IPTG诱导下获得了高效表达,经SDS-PAGE检测,证实表达产物大小约为41ku。 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖基因的原核表达及其产物的细胞毒性 总被引:1,自引:0,他引:1
参考GenBank中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)血清2型荚膜多糖基因的序列分别设计了3对特异性引物,通过PCR分别扩增了CpsA、CpsB、CpsC3个基因,获得长约1137、429、1146bp的片段,将其分别克隆到pMD18-T中,经酶切鉴定和序列分析获得了阳性克隆子;再将CpsA、CpsB、CpsC分别插入原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21,在IPTG诱导下获得高效表达,经Western-blotting检测证实,表达产物CpsC有生物学活性,CpsA、CpsB无活性;将3种表达产物等量混合,做10倍递进稀释后,与分离出的猪嗜中性粒细胞作用,37℃、50mL/L CO2培养箱中温育4h后加入底物液,测定D492nm值。结果表明,App荚膜多糖对猪嗜中性粒细胞无毒性作用。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达 总被引:6,自引:1,他引:6
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。 相似文献
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以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETIBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1447bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。 相似文献
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以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25_4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18_T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX_6P_1中,构建成重组表达质粒pGEX_apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS_PAGE电泳。结果表明,25_4株apxIVAgene与基因库中标准7型apxIVAgene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符。apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础。 相似文献
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参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型菌株,设计1对特异性引物,PCR扩增转铁结合蛋白B(tbpB)全基因,克隆到pMD19-T Simple载体中,经测序比较,与参考序列的核苷酸同源性达99.72%。试验将tbpB基因定向克隆到pET-32a( )中,转化BL21(DE3),经诱导后,SDS-PAGE结果显示转铁结合蛋白B得到表达,Western blot检测呈阳性。 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因特异片段的克隆和表达 总被引:3,自引:1,他引:3
以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组表达质粒pGEX-apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,25-4株apxIVA gene与基因库中标准7型apxIVA gene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符.apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础. 相似文献
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Apx毒素在胸膜肺炎放线杆菌致病性和免疫原性方面具有重要作用。为研究ApxI毒素的免疫活性,参照胸膜肺炎放线杆菌血清10型ApxIA基因核酸序列(D16582)设计1对引物.利用PCR自该菌株基因组DNA中扩增出3158bp的ApxIA基因片段,经克隆和序列测定后转入原核表达载体pET-32a中,通过转化BL21(DE3)并在IPTG诱导下进行原核表达,表达出约的融合蛋白,SDS-PAGE和Westernblotting鉴定结果显示表达产物大小约120kDa,且表达产物可与该菌株免疫兔血清发生结合反应。ApxIA基因的克隆和原核表达为研究ApxI毒素的免疫原性以及在胸膜肺炎放线杆菌中的生物学活性奠定了基础。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达 总被引:4,自引:3,他引:4
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板,PCR方法扩增出apx ,ⅢA基因3.1kb的片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定,并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较,结果显示核苷酸同源性均在96%以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ/Sal Ⅰ位点,成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA,转化大肠杆菌BL-21(DE3)中并获得表达。SDS—PAGE结果显示,表达的融合蛋白分子量约为140Ku,与预测相符,Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR扩增其apfA特异性基因片段,PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达质粒pGEX-apfA,转化到感受态大肠杆菌DE3中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳。结果表明,25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98%,所表达的融合蛋白相对分子质量约为42000,与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。 相似文献
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将构建保存的重组表达质粒pET-ApxⅠ A、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1用IPTG诱导表达,选择最佳的表达条件为IPTG 1.0 mmol/L,温度为37℃,表达时间为8 h,表达产物用SDS-PAGE鉴定,分别表达41、41、45 ku的蛋白,与预期蛋白大小一致.将表达产物用试剂盒进行纯化,得到较好的目的条带,并对其进行Western blot检测,经过分析,pET-ApxⅠ A、pET-ApxⅢA表达产物具有较好的免疫反应性. 相似文献
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