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[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200(含2% PVPP)凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门(Firmicutes),其次为恐球菌—栖热菌门(Deinococcus-Thermus)和变形杆菌门(Proteobacteria).用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础. 相似文献
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稻田土壤细菌宏基因组文库构建 总被引:1,自引:0,他引:1
为了从土壤宏基因组文库中筛选获得具有微生物农药活性的化合物及其基因簇,本研究构建了稻田土壤细菌宏基因组文库.采用直接裂解法提取土样DNA并对其纯化,之后RFLP-PCR分析土样DNA中细菌16S rDNA 基因的多样性,最后以提纯的土壤DNA为外源片段,以Fosmid载体构建了土壤宏基因组文库.提取纯化后的DNA片段大于23kb,RFLP-PCR分析土样DNA具有丰富的遗传多样性,构建获得的土样宏基因组文库约含10 000个克隆子,文库容量为3.56×10(8)bp.本研究掌握了构建土壤宏基因组文库的方法,构建的宏基因组文库可为后续的文库筛选以及获得绿色环保的微生物农药奠定了基础. 相似文献
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《西南农业学报》2018,(12)
【目的】通过宏基因组技术获取土壤微生物总DNA,运用基因克隆、功能筛选、基因表达等手段挖掘新型β-葡萄糖苷酶,为新型微生物资源的开发利用提供科学依据。【方法】提取高糖土壤宏基因组DNA,构建宏基因组文库;筛选文库并对阳性克隆子亚克隆,获得β-葡萄糖苷酶基因;PCR扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌进行表达;采用镍亲和层析对重组酶纯化,研究其酶学性质。【结果】成功构建约含9.2万个克隆的高糖土壤宏基因组文库,获得一个新型β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A。该基因大小为2241 bp,在氨基酸水平上,与Gen Bank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性为73%;该酶最适pH为6.0,最适温度为50℃,对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的K_m值为6.45 m M,V_(max)为50μmol/(mg·min)。在15~50℃热处理1 h后仍保留90%以上的酶活力,热稳定性较好,且被多种糖激活。【结论】宏基因组技术是获取新酶有效手段,获得的Unbgl3A具有良好酶学性质,可为进一步挖掘其应用潜力及研究耐热机理奠定基础。 相似文献
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利用宏基因组学方法,以人肠道微生物样品为原材料,构建了1个约30 000个克隆的fosmid文库.以三丁酸甘油酯为底物,通过功能筛选,获得1个酯解酶阳性克隆.对该阳性克隆构建亚克隆,挑选具有酯解酶活性的阳性亚克隆进行测序分析,最终获得1个肠道微生物来源的酯解酶基因(GenBank登录号:JQ972699).结果表明,文库克隆的平均插入片段约为40 kb,没有重复插入片段克隆.获得的酯解酶基因推演蛋白与Pyramidobacter piscolens W5455的patatin样磷脂酶同源性最高,氨基酸一致性为95%.生物信息学分析结果表明该基因可能通过Vd型分泌方式进行分泌并发挥功能.本研究是通过构建人肠道微生物宏基因组大片段文库并结合重组子功能筛选获得酯解酶的首次报道,可为食品工业提供新的酯解酶来源和筛选方法. 相似文献
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宏基因组学的研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养,主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选,可用于发现新基因、开发新的生物活性物质、研究群落中微生物多样性等方面。笔者对宏基因组学技术的方法和应用作了简要综述。 相似文献
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土壤微生物的宏基因组学及其研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法,是研究土壤微生物生态学的基础,也是获是土壤中各种基因资源的一种有效手段。介绍了土壤宏基因文库的构建、筛选及土壤宏基因组研究现状和这一技术的局限性。 相似文献