β-甘露聚糖酶的研究进展

β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶类,是一种广谱诱导型多功能酶,广泛存在于动植物和微生物中,其主要水解产物为甘露寡糖,在动物生产、饲料、食品、医药、石油开采及生物技术方面广泛应用.对β-甘露聚糖酶的来源、生产、纯化、分子特性、作用机制以及微生物诱变育种等方面的研究概况进行了综述,并对β-甘露聚糖酶的应用前景进行了分析.     

Athelia rolfsii的β-甘露聚糖酶纯化研究

从发酵培养5d的产β-甘露聚糖酶的Athelia rolfsii菌株CBS191.62发酵液中经硫酸铵沉淀、琼脂糖凝胶(DEAE Sepharose Fast Flow)层析、羟基磷灰石(Hydroxylapatite)层析和冷冻干燥结晶等步骤, 获得了比活提高了15.1倍,分子量为14.7 kD的凝胶电泳均一的β-甘露聚糖酶蛋白样品.     

β-甘露聚糖酶基因克隆与在大肠杆菌中表达

为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物．以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段．经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员．将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRsET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21 DE3（pLysS）,经过诱导获得了此酶的高效表达．     

黑曲霉β-甘露聚糖酶水解魔芋粉制备甘露低聚糖的研究

以魔芋粉为原料,研究了用黑曲霉β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的工艺条件.结果表明:反应时间、魔芋粉浓度、温度、加酶量、pH对酶法制备低聚甘露糖的工艺均有不同程度的影响,其中反应时间和温度影响较大,pH影响较小.通过正交试验确定了用黑曲霉β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的最佳工艺条件为:反应体系的pH4.2、魔芋粉浓度2.0%、温度65℃、加酶量108 U/g、反应时间为4.0 h.在最佳工艺条件下,低聚甘露糖的产率可达32.3%.     

蜗牛肝脏β-甘露聚糖酶的分离提取及纯化鉴定

从蜗牛肝脏组织制备粗酶液后,经硫酸铵分级分离和两次聚丙烯酰胺凝胶制备电泳,纯化到了蜗牛肝脏β-甘露聚糖酶。该酶经SDS-PAGE电泳分析显示为单一条带,其表观相对分子量为37KD。本法纯化的蜗牛肝脏β-甘露聚糖酶,比活力达到992.3U/mg,提纯倍数达8.45倍,回收率为25.12%。     

β-甘露聚糖酶的研究现状

综述了β-甘露聚糖酶的作用方式、生物来源、性质、遗传基础及应用。     

转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠的制备

为了获得β-甘露聚糖酶基因manA的转基因小鼠,从黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因manA,进行体外表达检测甘露聚糖酶活性后,将此基因插入到含有猪腮腺分泌蛋白(PSP)基因启动子的表达载体pPSPBGPneo中,得到在腮腺组织特异表达β-甘露聚糖酶基因manA的载体pPSP-manA,总长为16.3 kb,将其进行线性化后回收得到高质量DNA片段,通过显微注射得到17只原代小鼠,进行PCR和Southern blot检测发现有6只阳性转基因小鼠,表明转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠制备成功.     

黑曲霉产β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质研究

［目的］分离纯化黑曲霉固态发酵产生的β-甘露聚糖酶,研究β-甘露聚糖酶酶学性质。［方法］黑曲霉经固态发酵制备粗酶液,分别采用硫酸铵分段沉淀法、丙酮沉淀法和Sephadex凝胶层析法对β-甘露聚糖酶进行分离纯化,用PAGE检验其纯度。同时测定纯化后的β-甘露聚糖酶酶学性质。［结果］β-甘露聚糖酶经40%～90%饱和度硫酸铵沉淀法纯化后比活力可提高到1 180.9 U/mg 经1.0 ∶1.0～1.6∶1.0（V/V）丙酮沉淀法纯化后的比活力可提高到1 847.0 U/mg;最后经凝胶层析法纯化后的比活力可提高到7 950.4 U/mg,纯化倍数为8.67,在PAGE凝胶电泳图谱上得到单一条带,即纯化后的β-甘露聚糖酶。［结论］纯化后β甘露聚糖酶的酶学性质为：最适pH值4.2,最适反应温度60 ℃,米氏常数Km 2.67 mg/ml。     

枯草芽孢杆菌MSJ-5产β-甘露聚糖酶的性质研究

对土壤中分离的1株产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌MSJ-5进行产酶性质的研究。菌株MSJ-5在发酵培养基中培养32h达到产酶高峰。β-甘露聚糖酶为粗酶液的主要组分,酶学性质的研究显示该酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.0,在pH 5.0~7.0能保持较好的稳定性。水解魔芋甘露聚糖及水解产物分析试验结果表明菌株MSJ-5产生的β-甘露聚糖酶对魔芋甘露聚糖有显著降粘效果,水解产物以甘露寡糖为主。研究结果显示,菌株MSJ-5产生的β-甘露聚糖酶有应用到饲料添加和功能性寡糖行业的潜力。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究

黑曲霉(Aspergillus niger)WM20-11固态发酵成熟曲,经磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分步盐析、DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析等分离纯化手段,最终获得了Native-PAGE、SDS-PAGE纯的酸性β-甘露聚糖酶组分,其纯化倍数为25.08,收率为5.1%。Sephadex G-100凝胶过滤层析和SDS-PAGE测得纯酶的相对分子质量分别为39 kD和40 kD,表明该酶以单体形式存在;IEF-PAGE测得该酶的等电点为4.0;含糖量测定为19.6%;酶蛋白氨基酸组成中(Asp+Glu)/(Lys+Arg)为3.74。     

β-甘露聚糖酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究

从土壤中分离得到一株产酶活性高的β-甘露聚糖酶芽孢杆菌,该菌产酶迅速,在简单发酵培养基中培养32 h即可达到产酶高峰,且粗酶液中甘露聚糖酶的量占绝对优势。对酶性质的研究发现,酶的最适反应温度为50℃,最适pH值为7.0,在pH值为5.0~7.0时能保持很好的稳定性,黏度试验显示降黏效果显著,薄板层析显示水解魔芋甘露聚糖和角豆胶产物以甘露寡糖为主,有应用到饲料酶制剂和寡糖生产行业的潜力。     

CXJZ95-198菌株β-甘露聚糖酶的纯化条件研究

研究通过超滤、硫酸铵沉淀、丙酮沉淀及凝胶层析等纯化步骤,将CXJZ95-198菌株所分泌的β-甘露聚糖酶进行了纯化,其纯化倍数为12.05,收率为33.50;.通过SDS-聚丙烯酰胺电泳得到单一条带蛋白,分子量为52.29 kD.     

β-甘露聚糖酶高产基因工程菌株发酵条件优化

采用正交试验对1株基因工程菌株的种子培养基与发酵培养基进行优化。通过在3因素（碳源、生长素、无机盐）3水平上进行正交试验,确定种子培养基成分为：0.5%牛肉膏,0.5%葡萄糖,0.5%蛋白胨,0.35%NaCl,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4;发酵培养基的成分为：0.5%牛肉膏,0.3%魔芋精粉,0.5%蛋白胨,0.35%NaCl,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4;产酶高峰时段为10～12 h之间,最适的发酵温度为35℃,最高酶活可达775 U/ml。     

酸性β-甘露聚糖酶的固态发酵工艺研究

在对黑曲霉WM20-11产酸性β-甘露聚糖酶的培养基组分和培养条件单因素研究的基础上,设计了Plackett-Burman试验选取主要影响因素,并进行响应面分析。结果表明,黑曲霉WM20-11产酸性β-甘露聚糖酶的最适培养基和发酵条件为:水11.7mL,麸皮9.0g,豆饼粉1.0g,魔芋粉0.98g,玉米浆0.375mL,(NH4)2SO412.5g/kg,CaCl21.0g/kg,MgSO41.0g/kg,KH2PO42.5g/kg(相对于固体料),自然pH;28℃固体静置培养96h,期间翻曲2~3次。在此条件下,菌株产酶活性可达1337IU/g干曲。     

β-甘露聚糖酶异源表达及甘露寡糖制备研究

以产β-甘露聚糖酶(MAN)的枯草芽孢杆菌HD145为目的菌株,PCR扩增MAN基因片段,克隆到p HBM905A载体并转化至毕赤酵母,重组子利用甲醇进行诱导。纯化的MAN酶解槐豆胶与瓜尔豆胶,质谱检测水解产物。SDS-PAGE结果表明,MAN基因实现了表达,摇瓶酶活性为3 200 U/m L,酶最适温度与pH分别为55℃与6.0,pH 4~7时稳定性较好,在40、50、60℃的半衰期分别为165、105、42 min,Zn~(2+)、Ag~+、Co~(2+)对酶活性存在一定的抑制。槐豆胶与瓜尔胶经MAN酶解后得到二糖至十糖的寡糖。     

β-甘露聚糖酶对断乳仔猪猪瘟抗体效价的影响

[目的]研究β-甘露聚糖酶对早期断乳仔猪猪瘟抗体效价的影响。[方法]采用单因子随机化设计,将所选的72只28±2日龄平均体重(7.04±0.43)kg的健康断奶仔猪(杜×长大)按体重相近、公母各1/2的原则随机分为4组,每组3个重复,每个重复6头猪。组1~4在饲喂基础日粮的基础上分别添加β-甘露聚糖酶0、0.025%、0.05%、0.1%。饲养期为4周。猪瘟抗体用正向间接血凝法(IHA)测定。[结果]结果表明:56日龄时组23、4、的猪瘟抗体效价比组1显著提高(P<0.05)。[结论]一定剂量的β-甘露聚糖酶可以提高猪瘟抗体效价。该研究为甘露聚糖酶在养殖业中的应用提供科学的理论依据。     

1株青霉固体发酵产酸性β-甘露聚糖酶条件优化

[目的]为产酸性β-甘露聚糖酶菌株的开发与应用提供技术依据。[方法]以1株青霉QM-1为出发菌株,通过单因素试验和正交试验对其固体发酵产β-甘露聚糖酶的条件进行优化。[结果]该株青霉产β-甘露聚糖酶的最适培养基配方为:0.5 g魔芋粉,20.0 g麸皮,1.5 g蛋白胨,0.3 gKH2PO4,0.03 gMgSO4.7H2O,初始pH值为5.5,反应pH值为5.8,含水量为60%。该株青霉产-β甘露聚糖酶的最适培养条件为:将在30 g基础培养基放在250 ml三角瓶中,接入菌种在35℃下培养3 d后,最高酶活力可达1 455.63 IU。[结论]当反应pH值为5.2～6.0时,-β甘露聚糖酶能维持较高的活性,这表明该菌所产β-甘露聚糖酶为酸性。     

青霉QM-1产酸性β-甘露聚糖酶液体发酵条件研究

[目的]为酸性β-甘露聚糖酶生产菌株的开发与应用提供技术参考。[方法]以单因子试验和正交试验对青霉QM-1（Penicillium sp．）液体发酵产酸性β-甘露聚糖酶条件进行研究。[结果]产酶最适培养基配方：麸皮＋魔芋粉（2：1）10．0g／L,NaNO3 2．0s／L,KH2PO4 1．5g/L,MgSO4·7H2O 0．3g／L,H2O 1000ml。最适培养条件为：起始pH值6．0,装液量为50ml／250ml三角瓶,转速为175r／min,在35℃下培养4d,最高酶活力达86．3IU。该菌所产粗酶液最适反应温度为60℃。[结论]麸皮和硝态氯能有效促进青霉QM—1产酸性β-甘露聚糖酶,且所产的β-甘露聚糖酶有一定的温度耐受性。     

产β-甘露聚糖酶菌株育种及培养基优化

利用实验室筛选保藏最高酶活为10.7 U/mL的白腐真菌作为出发菌株,进行紫外诱变育种及培养基优化,以期提高菌株产β-甘露聚糖酶能力.结果表明,紫外诱变条件为孢子悬液浓度106～107个/mL,诱变时间10 min,此条件下的孢子致死率达78％,获得了13株正向突变株,经6代遗传稳定性试验证明UV-2突变株酶活最高,遗传稳定性最强,比出发菌株酶活提高了2.075倍.通过单因素试验确定了该突变株的最佳碳源、氮源分别为魔芋粉和硝酸铵,对酶活影响较大的无机盐为磷酸二氢钾.通过正交试验,确定了最佳产酶培养基为魔芋粉4.0 g/L、NH4NO3 5.0 g/L、KH2PO4 5.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O1.0 g/L,在此条件下测得甘露聚糖酶最大酶活为46.17 U/mL,比优化前提高了40.3％.     

产β-甘露聚糖酶菌株的物理和化学诱变育种研究

[目的]比较产β-甘露聚糖菌株的物理和化学诱变育种效果。[方法]以产β-甘露聚糖酶的Bacillus subtilis WD23为出发菌株,利用紫外线诱变和甲基磺酸乙酯诱变的方法提高酶的活性。[结果]紫外线照射时间选为20～30s,诱变后酶活提高了8．72％;1％的甲基磺矗乙酯诱变10min,酶活提高了1．29％。[结论]紫外线诱变效果好于甲基磺酸乙酸,该研究中,物理诱变效果好于化学诱变。