斑翅果蝇的PCR-RFLP快速鉴定方法

应用PCR-RFLP技术分析斑翅果蝇及其相关种间的差异。选用果蝇COI基因通用引物并通过PCR扩增斑翅果蝇、亚艳丽果蝇等11种15个样品COI基因序列,对PCR产物进行回收和测序,根据测序结果及NCBI上序列比对结果,选用限制性内切酶ApaⅠ和HinfⅠ分别对果蝇COI基因PCR产物进行酶切,酶切产物经琼脂糖电泳分析。结果表明:同时使用ApaⅠ和HinfⅠ酶,可以将斑翅果蝇与其他种相区分。根据果蝇COI基因建立的PCR-RFLP技术可对斑翅果蝇快速、准确进行鉴定。     

matK序列作为DNA条形码在苍耳属中的应用

以matK序列作为DNA条形码,对从国外截获的7种苍耳属植物进行物种区分鉴定研究,采用DNeasyOPlantMiniKit试剂盒进行总DNA的提取,应用通用引物对其matK基因进行扩增,测序得到7种苍耳属植物的marK序列,利用MEGA5．1软件对这7种苍耳属植物的matK序列进行比对和分析并构建系统树,结果显示：matK序列能从基因位点层面对苍耳属植物进行区分鉴定。     

一种快速、有效的香蕉枯萎病病原菌FOC4的分子检测方法

以ITS测序与SCAR分子标记相结合的香蕉病原菌FOC4分子检测方法,利用通用引物ITS1和ITS4对病原菌SF001的rDNA中ITS序列进行PCR扩增,获得560bp左右的特异条带。经Blast分析比对,确定该菌为FOC。再利用FOC4的特异引物PCL/PDL对基因组上的特征序列扩增区域(SCAR)进行PCR扩增,获得677bp的特有序列,鉴定菌株SF001是尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。经过致病性测试,菌株SF001表现出典型4号生理小种的病理特征。     

基于DNA条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定

为筛选合适的基因序列对镰刀菌属Fusarium真菌进行检测鉴定,以从不同寄主分离获得的11种57株镰刀菌为材料,选择nr DNA-ITS、EF-1α、mt SSU和β-tubulin作为候选基因,将序列获得的难易程度和种内与种间遗传距离频率分布作为评价指标,对测序获得的有效序列进行研究,筛选出该属的DNA条形码。结果表明:EF-1α基因具有较高的PCR扩增与测序成功率,为98.2%,较mt SSU和β-tubulin基因更容易获得序列片段;且种内与种间遗传距离重叠部分较少,除木贼镰刀菌F.equiseti种内遗传距离为0.029,大于黄色镰刀菌F.culmorum和禾谷镰刀菌F.graminearum种间遗传距离0.021外,种间差异明显大于种内差异,优于其它基因,能更好地区分镰刀菌;利用EF-1α基因序列构建的系统发育树显示,相同种聚集在同一分支,不同种划分在不同分支,鉴别能力较好;EF-1α基因不能扩增出其它6株非镰刀菌属的主要植物病原真菌,而对镰刀菌的PCR扩增效果很好,电泳检测结果条带单一、明亮。表明EF-1α基因可作为镰刀菌属鉴定的DNA条形码。     

基于聚合酶链式反应-高通量测序(PCR-HTS)联用的cry2A基因鉴定方法

cry2基因对多种鳞翅目害虫具有高毒力,且与cry1A类基因无交互抗性,具有重要的应用价值。为了提高苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)cry2杀虫基因资源的筛选和鉴定效率,本研究分析了所有已报到的cry2A基因的保守区,设计了4对通用引物,对2000株Bt菌株基因组DNA混合样品进行了PCR扩增,并利用454高通量测序仪对这些混合扩增产物进行了测序。测序总量有280704条Reads,序列分析结果表明,这些Bt菌株中含有已知的所有9类cry2类基因,其中包括cry2Ae和cry2Ai这2类在国内Bt菌株中未见报道的基因;同时,发现了新型cry2类基因的片段;随后设计特异性引物,扩增获得了半长基因片段cry2-1和cry2-2,进一步利用重叠PCR法获得了全长新基因cry2X,该基因的编码区为1902 bp,编码633个氨基酸;其氨基酸序列与Cry2Ab13蛋白的相似性最高,为93%,属于第三等级的模式基因。建立聚合酶链式反应-高通量测序(polymerase chain reaction-high throughput sequencing,PCR-HTS)联用的基因鉴定方法,具有快速、灵敏、准确、高通量、覆盖范围广等优点,不仅可以对Bt菌株中已知杀虫基因进行鉴定,而且能够发现新的基因,将在Bt基因鉴定、发掘中发挥重要的作用。     

百合根腐病病原分离与鉴定

【目的】百合根腐病是严重为害百合鳞茎的一种土传病害,其病原种类多样,已成为遏制百合产业发展的重要因素之一。研究从百合根腐病的病样中分离得到多种分离物,选取其中2种做进一步鉴定。【方法】采用组织分离法对江西省鹰潭市余江区杨溪乡发生的百合根腐病样品进行病原分离,进一步通过形态观察、ITS和tef1序列比对以及致病性测定对病原进行鉴定。【结果】明确引起百合根腐病的病原为藤仓镰刀菌（Fusarium fujikuroi）和茄病镰刀菌百合专化型（Fusarium solani f. sp. lilii Wang）。【结论】研究从江西余江区采集的龙牙百合病鳞茎组织上分离得到两种代表性镰刀菌,分别为藤仓镰刀菌和茄病镰刀菌百合专化型。研究结果为百合根腐病的预防和防治提供了参考依据。     

trnH-psbA序列作为DNA条形码在苍耳属杂草鉴定中的应用

以trn H-psb A序列作为DNA条形码,对从国外截获的9种苍耳属杂草及1种国内苍耳进行物种鉴定研究。采用DNeasy Plant Mini Kit试剂盒进行总DNA的提取,应用通用引物对其trn H-psb A基因进行PCR扩增,测序得到10种苍耳属杂草的trn H-psb A序列,并利用MEGA 7.0软件进行比对分析构建系统进化树。结果显示:苍耳属杂草trn H-psb A基因序列共有543个位点,其中有53个变异位点,31个变异信息位点,22个单突变位点,30个碱基缺失;种间遗传距离为0~0.093,种内无遗传差异;进化树显示10个苍耳物种均处于独立分支,能够利用该条形码对苍耳属杂草进行区分鉴定。     

基于DNA条形码技术的泰国番石榴中实蝇幼虫分子鉴定研究

实蝇是世界重要的检疫性害虫之一,对果蔬生产及其国际贸易具有很大的影响。而以线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚单位I(mtDNACOI)基因的部分序列作为实蝇的DNA条形码能减少对实蝇成虫形态特征的依赖,可检测其任何虫态的样品,有助于实蝇样品的快速鉴定。本研究采用DNA条形码技术,针对采自泰国四色菊市番石榴烂果中的5头实蝇幼虫进行COI扩增测序,与生命条形码数据库(BOLD)中的序列进行比对并利用PAUP4.0软件构建了其系统进化树。根据序列分析和系统进化关系分析的结果,将5头实蝇幼虫样品鉴定为番石榴实蝇(Bactrocera correctaBezzi),并将本研究获得的2条COI序列在GenBank中注册,GenBank的登录号为HM590450和HM590451。     

基于DNA条形码的向日葵田弯管列当种群遗传多样性研究

弯管列当是危害我国向日葵最严重的寄生杂草。为了明确我国向日葵田弯管列当种群的遗传多样性,本试验利用rbcL、matK、ITS2条形码序列对采自我国向日葵主产区的58份弯管列当样品进行PCR扩增及测序,采用Vector NTI软件对测序结果进行剪切比对,利用MEGA 6.0软件计算种内遗传距离并构建系统发育树。利用扫描电镜观察其种子的显微形态特征。结果表明,3个DNA条形码序列中仅ITS2片段扩增测序结果理想并表现出较好的聚类结果。各样品ITS2序列剪切比对后长度为453 bp,种内遗传距离为0.002～0.007,通过比较各样品ITS2序列的碱基组成和差异位点,能将不同弯管列当种群区分开。ITS2聚类结果表明58份弯管列当样品聚为3类,分别为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。形态分类结果表明,不同类型弯管列当在植株形态、种子形状及微观形态结构等方面存在差别。由于不同弯管列当种群的生境、寄主(向日葵栽培品种)不同,其种群遗传进化差异显著。基于ITS2条形码和扫描电镜形态学观察相结合的方法可用于弯管列当种群遗传多样性研究。     

福建永安市辣椒丛枝病植原体的分子检测及鉴定

永安地区发病辣椒植株表现小叶、黄化、丛枝、簇芽等症状。利用植原体16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR2和R16F2n/R16R2,对发病辣椒植株总DNA进行巢式PCR检测,获得约1.2kb的特异性DNA片段。经测序并在GenBank数据库进行比对分析,共获得4条植原体特定的16SrDNA基因序列(CHY-C4-1、CHYY1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1)。将测得的4条序列与已报道的植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,结果显示获得的4条植原体序列均聚类到16SrI组,其中CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1与16SrI-B亚组植原体聚类到同一支,而CHY-C4-1与已报道的16SrI组内的6个亚组均未聚类到一支,因此建议将CHY-C4-1命名为新的亚组。利用iPhyClassifier在线分析软件对获得的4条植原体序列进行虚拟RFLP分析,结果与进化树获得的结果一致。     

甘薯杆状病毒湖南分离物基因组全序列测定及比较分析

 利用Small RNA测序技术对采自湖南的甘薯杆状病毒进行鉴定,获得与SPBV-B序列具有相似性的contigs 161个。首先设计小片段引物,PCR扩增分离出706 bp的目的片段,与SPBV-B (FJ560944)相似性为78%。分段设计引物,进行基因全序列PCR扩增。引物组合SPBV-BF1/R1、SPBV-BF2/R4和SPBV-BF5/R5分别扩增出3 150、2 900和3 500 bp目的条带。序列拼接获得2个SPBV-B基因组全序列,大小分别为7 894 bp(MK052980)和7 981 bp(MK052981),包含完整编码阅读框。进化分析表明MK052980和MK052981与SPPV聚为同一分支,与SPPV相似性分别为81%和83%,与SPBV-B相似性分别为86%和94%。MK052980和MK052981具有89.5%的相似性。经编码阅读框氨基酸序列比对,MK052980序列的ORF3a氨基酸序列存在变异。这是国内首次报道SPBV-B全基因序列。     

甘薯杆状病毒湖南分离物基因组全序列测定及比较分析

 利用Small RNA测序技术对采自湖南的甘薯杆状病毒进行鉴定,获得与SPBV-B序列具有相似性的contigs 161个。首先设计小片段引物,PCR扩增分离出706 bp的目的片段,与SPBV-B (FJ560944)相似性为78%。分段设计引物,进行基因全序列PCR扩增。引物组合SPBV-BF1/R1、SPBV-BF2/R4和SPBV-BF5/R5分别扩增出3 150、2 900和3 500 bp目的条带。序列拼接获得2个SPBV-B基因组全序列,大小分别为7 894 bp(MK052980)和7 981 bp(MK052981),包含完整编码阅读框。进化分析表明MK052980和MK052981与SPPV聚为同一分支,与SPPV相似性分别为81%和83%,与SPBV-B相似性分别为86%和94%。MK052980和MK052981具有89.5%的相似性。经编码阅读框氨基酸序列比对,MK052980序列的ORF3a氨基酸序列存在变异。这是国内首次报道SPBV-B全基因序列。     

景天属多肉植物基于ITS条形码鉴定探析

在多个条形码基因研究的基础上,本研究以ITS序列为目的片段通过DNA条形码技术对口岸截获的景天属多肉植物进行快速鉴定。采用通用引物扩增景天属10种32个供试样本的ITS片段并双向测序拼接,利用MEGA7软件进行序列比对,分析种内种间K2P距离并作barcoding gap,构建系统发育树。结果表明供试材料ITS序列的种内变异明显小于种间差异,种内种间变异存在明显的间隔区,每种的所有样品在NJ树上严格聚成单系,种间区分明显。初步判定ITS具有作为景天属多肉植物DNA条形码的潜在可能。     

臭矢菜丛枝病植原体的分子鉴定研究

 本实验采用DAPI荧光显微镜、PCR、克隆和测序等技术,对海南臭矢菜丛枝病样进行了检测和鉴定。以染病臭矢菜总DNA为模板应用3对植原体特异性引物进行PCR扩增,获得PCR产物为16S rDNA(1 430 bp)、16S-23S rDNA(358bp)、rp DNA(1 294 bp)。应用DNA回收试剂盒获得了3个PCR扩增片断的纯化产物,并克隆到DH5α大肠杆菌中测序。应用DNAMAN和MEGA软件对获得的序列与NCBI数据库中植原体序列进行同源性分析和构建系统发育树。结果显示臭矢菜丛枝病植原体与花生丛枝病植原体序列同源性最高,16S rDNA的序列同源性为99.9%,16S-23S rDNA高达100%,rp为99.7%,因而将臭矢菜丛枝病植原体归为花生丛枝组(16SrⅡ),根据16S rDNA的RFLP分析,将其归为16SrⅡ-A亚组。     

美国剪股颖种子中剪股颖粒线虫的检疫鉴定

剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)是牧草和草坪上重要的有害生物,被我国列入检疫性有害生物名录。2018年,上海口岸从来自美国的细弱剪股颖种子中截获1种粒属线虫,由于该样品中仅分离得到幼虫,无法进行准确鉴定。本文采用形态学与分子生物学相结合的方法进行检测。采用28S通用引物扩增该线虫序列,测序获得741 bp的序列,与GenBank中登录的Anguina agrostis相似性达99.85%～100.00%;对ITS区扩增并测序,获得776 bp的序列,与GenBank中登录的Anguina agrostis的相似性达99.60%～100.00%。基于28S及ITS区序列构建的系统进化树均显示,该线虫与Anguina agrostis位于同一进化枝上。进一步采用剪股颖粒线虫鉴定国标方法推荐的特异引物对线虫进行PCR扩增,出现目的条带。综合形态学特征及分子鉴定结果,该粒属线虫群体鉴定为剪股颖粒线虫。     

剪股颖粒线虫幼虫形态与分子检测方法

剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)是牧草、草坪上的重要线虫,该线虫在进口草籽中常以幼虫形态出现,与其它粒线虫属幼虫形态相似,很难快速鉴定到种.本实验通过对单条幼虫DNA进行提取和PCR扩增,获得其rDNA的ITS区域,测序后与基因库中的剪股颖粒线虫的rDNA的ITS区域序列进行比较,其结果与基因库中编码为AF396343.1的核酸序列吻合,从而鉴定为剪股颖粒线虫.此外,还使用5种限制性内切酶对PCR产物进行了酶切,获得了剪股颖粒线虫的ITS-RFLP指纹图谱.     

车前草穗枯病菌分子鉴定

采用真核生物通用引物ITS1/ITS4,对来自江西省吉安县2个车前草穗枯病菌菌株进行rDNA-ITS区段的PCR扩增,对扩增产物进行测序,结果获得2个长度均为579 nt且序列完全一致的rDNA-ITS序列,该序列与GenBank中当归间座壳菌(Diaporthe angelicae)及其无性态拟茎点霉菌(Phomopsis subordinaria)对应序列的同源性高达99.0%,根据以rDNA-ITS序列同源性大小划分种类的标准,将车前草穗枯病菌鉴定为当归间座壳菌。     

基于全长转录组测序的稻秆潜蝇解毒代谢相关基因筛选

为筛选水稻害虫稻秆潜蝇Chlorops oryzae潜在的解毒代谢酶基因，利用PacBio Sequel Ⅱ测序平台对稻秆潜蝇幼虫进行全长转录组测序，基于测序结果筛选稻秆潜蝇的解毒代谢相关基因谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）基因、羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）基因和细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）基因，并检测其在稻秆潜蝇不同发育阶段的相对表达量。结果表明，对稻秆潜蝇进行测序得到18 100条去冗余转录本序列，共有16 283条序列得到注释。通过比对分析共筛选出8条GST、12条CarE和28条CYP450基因序列，这些基因在稻秆潜蝇不同发育阶段的表达量具有显著差异，表明不同虫态的稻秆潜蝇其解毒代谢能力可能不同。此外，还筛选到1 452个lncRNA序列，以及176个潜在的lncRNA靶基因序列，其中4个与解毒代谢基因相关。表明筛选获得的稻秆潜蝇解毒代谢酶基因及lncRNA靶基因可用于后续该虫的潜在抗药性研究及防治药剂筛选。     

山西省枣树上啤酒花矮化类病毒的检测及序列分析

［目的］ 从枣树样品中分离鉴定啤酒花矮化类病毒（HSVd）。［方法］ 从山西省农业科学院果树研究所国家枣种质资源圃采集70份枣树叶片样品,提取小分子RNA后通过Northern杂交、RT PCR进行检测,并对阳性样品中的类病毒进行克隆测序,利用生物学软件对所得序列进行分析。 ［结果］ 70份枣树样品中有1份样品感染HSVd,克隆测序后,共获得13条HSVd序列,它们与GenBank上首次报道的HSVd序列相似性为92.6%~92.8% 。［结论］ 本研究首次在国内报道了枣树上分离得到的HSVd序列,HSVd枣树分离物与已报道的HSVd分离物差异较大。     

大豆花叶病毒CP基因RNAi载体的构建及大豆遗传转化

为获得含有大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）CP基因干扰片段的转基因大豆新材料,对11个SMV流行株系的CP基因进行了核苷酸序列比对,采用GATEWAY技术构建了RNA干扰（RNA interference,RNAi）载体pB7GWIWG2（Ⅱ）-CPi,对重组载体测序比对,通过酶切以及PCR方法鉴定载体,并利用农杆菌介导的转基因体系进行大豆遗传转化。克隆出264 bp高度保守的CPi干扰片段,通过测序证实其与目标序列的匹配度达到100%;重组质粒经过XbaⅠ单酶切后出现783 bp和10 818 bp两条带,经过EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现2 256 bp和9 346 bp两条带,说明2个ccdB结合位点均被CPi取代;PCR反应得到474 bp和460 bp两条带,说明CPi以反向重复形式与pB7GWIWG2（Ⅱ）组合。共获得10棵T₀代转基因幼苗,经除草剂涂抹、PCR、PAT/bar转基因检测试纸检测后,6株为阳性,表明该方法可筛选出对大豆花叶病毒具有抗性的转基因大豆新种质,为SMV抗病育种工程提供良好的亲本材料。