新城疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

以新城疫病毒F基因的cDNA与真核表达载体pcDNA3重组 ,构建了新城疫病毒F基因疫苗。采用不同剂量接种SPF鸡后 ,通过抗体监测和强毒攻击试验 ,分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明 ,接种剂量为1 0 0 ,2 0 0ug时 ,试验鸡在免疫后第 2周出现较明显的抗体反应 ,接种剂量为 1 0ug时抗体变化不明显。以标准强毒F4 8E9攻击后 ,空白对照组及接种剂量为 1 0 ,1 0 0ug组的鸡只全部发病死亡 ,未获得免疫保护 ;而 2 0 0ug组鸡只 30 %存活 ,获得部分免疫保护。表明基因免疫效果与接种的剂量有密切的关系     

鸡新城疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

本研究以新城疫病毒 Ｆ 基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 与真核表达载体ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 重组，构建了新城疫病毒 Ｆ基因疫苗。采用不同剂量接种 Ｓ Ｐ Ｆ鸡后，通过抗体监测和强毒攻击试验，分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明，接种剂量为１００μｇ、２００ μｇ 时，试验鸡在免疫后第 ２ 周出现较明显的抗体反应，接种剂量为 １０ μｇ 时抗体变化不明显。以标准强毒 Ｆ４８ Ｅ９ 攻击后，空白对照组及接种剂量为１０ μｇ 和１００ μｇ 组的鸡只全部发病死亡，未获得免疫保护；而２００ μｇ 组鸡只全部存活，获得完全免疫保护。表明基因免疫效果与接种的剂量有密切的关系。     

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的筛选

将转移载体P11SF和PN11SF分别与282E4株鸡痘病毒（282E4 strain fowlpox virus，282E4FPV）和大空斑株鸡疽病毒（large plaque strain fowlpox virus，LP FPV）共转染鸡胚成纤维细胞，通过蓝斑筛选，得到4株重组鸡痘病毒rFPV282E4-SFA、rFPVLP，-SFA、rFPV282E4-SFB和rFPVLP-SFB，通过PCR和间接免疫荧光鉴定均为阳性，另外将各重组病毒分别传20代，测其遗传稳定性，结果显示均具有良好的稳定性。对SPF鸡进行免疫效力试验，攻毒后均100％保护，而对于商品鸡，保护率分别为64％、60％、52％和88％。     

5株鸡源新城疫病毒F基因特性分析

为调查山西省鸡源新城疫病毒(NDV)的流行现状,2012—2013年从山西省部分地区的发病鸡群分离、鉴定出5株NDV,并对这5株NDV的分子生物学特性进行了研究。对各分离株F基因序列的分析表明:其中的4株病毒在基因型分类上属于基因Ⅱ亚型,并与标准弱毒疫苗La Sota株高度同源,为99.2%⁹9.4%。氨基酸序列同源性为100%,且裂解位点氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,符合弱毒株裂解位点特征。另一分离毒株在基因型分类上与JS/5/01/Go同属基因Ⅶd亚型,两者基因序列同源性为95.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。其裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,为强毒株裂解位点特征。     

鸡新城疫病毒F基因和鸡IL—2重组DNA疫苗的构建

利用已克隆到的新城疫D26株F基因和鸡IL－2基因，经过载体改建，将他们共同克隆于真核表达质粒pCDNA3上，经酶切分析、PCR鉴定证实成功构建了共表达鸡新城疫病毒F基因和鸡IL－2的重组质粒，为探讨禽类重组基因疫苗的构建及鸡IL－2在基因疫苗中的作用奠定了基础。     

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒（rFPV282E4-SF，rFPV Lp-SF）的遗传稳定性，将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度，结果所有蚀斑100％变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定，所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致，没有发生任何改变。随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPV LP-FS各个代次F基因的特异表达。所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒：艮有良好的遗传稳定性，满足兽医生物制品的遗传稳定性要求。     

鹅源新城疫病毒F基因的克隆及其序列分析

鹅新城疫是近年来我国新发现的能感染多种禽类的传染病，国内许多学者在该病的发生、发展规律以及分子病毒学等领域有了较多的研究，现已确定该病毒是禽副粘病毒Ⅰ型即新城疫病毒的一个变种。本实验选择最近分离的2株鹅源新城疫病毒，采用已经发表的鸡新城疫病毒序列设计引物，应用RT—PCR技术扩增鹅源新城疫病毒的F基因，并将其克隆至载体上，然后进行了核苷酸序列测定、进行了系统的分析，并根据遗传距离的远近确定了鹅源新城疫病毒在NDV系统发育进化树中的地位。     

鸡IL-2在新城疫病毒F基因疫苗免疫中的作用

利用国内首次克隆成功的鸡 IL- 2基因真核表达质粒与新城疫病毒 (NDV) D2 6株 F基因真核质粒 (F基因疫苗 )联合免疫 SPF雏鸡 ,观察了其诱导的免疫应答及免疫保护作用 ,以及不同免疫方式对其免疫作用的影响。结果证实了国内克隆鸡 IL- 2基因的免疫增强作用 ,以及作为免疫佐剂应用于禽类基因免疫的可行性 ,为鸡 IL- 2这一新型佐剂的实际应用提供了重要的试验依据。     

新城疫病毒F基因重要功能区和HN基因单核苷酸多态性研究

对广泛应用的新城疫疫苗株La Sota进行了全基因组测序,并对来自9个不同基因型新城疫病毒株的血凝素神经氨酸酶(haemagglution-neuraminidase,HN)基因和融合蛋白(fusion protein,F)基因47～435 nt区域进行了用单核苷酸多态性(SNP)分析.结果表明:在F基因47～435nt间和HN基因中都存在高密度的SNP位点,Tajima's D检验结果表明这些核苷酸变化符合中性突变假说,Pi(a)/Pi(s)分析暗示F蛋白编码基因N端的一些区段和HN蛋白编码基因中散在的部分区域受到了正向选择.但F基因和HN基因在整体上却都受到了强大的负向选择压力的影响.     

孔雀新城疫病毒F基因的克隆及其变异分析

为了对上海珍禽场送检的2只疑似新城疫病毒(NDV)感染的孔雀进行确诊,本研究对其进行了细菌分离和NDV荧光RT-PCR检测以及NDVF基因的序列分析,结果发现内脏病料样品的NDV荧光RT-PCR检测为阳性;通过DNAStar序列分析,F基因与其它参考株核苷酸同源性为81.1%～96.8%,与EF592508黑龙江毒株的同源性高达96.8%,基因系统进化树分析表明,该病毒株与黑龙江毒株的关系较近,均为强毒株。     

新城疫病毒的F蛋白与遗传学分群

有关新城疫病毒（Newcastle Disease VIrus,NDV)变异株的分类，传统上主要采用临床症状或致病性试验或抗原分群，但随着NDV在全球的蔓延及其分子生物学研究的不断深入，传统的分类已不能提供更多的流行病学信息，目前，分子流行病学已用于NDV变异毒株的分类，即遗传学分型。     

野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源.结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析.结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时I、II、V和IX多种基因型并存.同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论.     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

野鸭源新城疫病毒的分离及其F基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法扩增从野鸭体内分离到的3株新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)(JS-1/06/wd、JS-2/06/wd和JS-3/06/wd)F基因,并对其序列进行了测定和分析。结果表明该分离株的F基因长1 662 bp,编码553个氨基酸;F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K/R-R-F117,符合NDV强毒株的特征。这些毒株间核苷酸同源性为99.8%~99.9%,与鹅源NDV QY971株和ZJ1株的核苷酸同源性也高达96.7%~97.5%;氨基酸同源性为96.8%~97.5%;而与我国标准强毒株F48E9及疫苗株LaSota的核苷酸同源性分别为86.9%和84.5%;氨基酸同源性分别为94.5%和87.0%。系统发育树分析结果表明,野鸭源NDV与鹅源NDV的遗传关系较近,同属于基因Ⅶ型。     

野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源。结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析。结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和Ⅸ多种基因型并存。同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论。     

新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析

本试验首先以ＮＤＶＦ４８Ｅ９株的基因组ＲＮＡ为模板,逆转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第一链,再通过ＰＣＲ技术扩增Ｆ基因的ｃＤＮＡ,然后将其克隆到质粒ｐＵＣ１９中,经分子量比较、酶切分析、ＰＣＲ等方法证明,我们已经获得了ＮＤＶＦ４８Ｅ９株Ｆ基因的阳性克隆。经初步序列分析,ＦＡ段核苷酸序列与参考株（Ｄ２６／７６）序列同源性为８９％,ＦＢ段同源性为９１％。二者的氨基酸序列表明,Ｆ４８Ｅ９株Ｆ蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即１１２ＲＲＱＲＲ１１６Ｆ１１７。这两段序列中包含的三个Ｃｙｓ残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。     

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.