巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

巴西橡胶树AnnHb1基因的克隆及表达分析

根据一个从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码annexin的cDNA,命名为AnnHb1。序列分析表明,AnnHb1长为1 198 bp,含有945 bp的阅读框,62 bp的5'-UTR和191 bp的3'-UTR,编码314个氨基酸,分子量为35.99 ku,等电点为8.18。该氨基酸序列与蓖麻、麻疯树、棉花、苜蓿、烟草和拟南芥中的annexin的同源性分别为82%、72%、72%、64%、60%和60%。半定量RT-PCR分析结果表明AnnHb1基因在愈伤、花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在愈伤组织中表达量最低,树皮中表达量最高。     

巴西橡胶树磷转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析

植物磷转运子Pht1家族是一类H2PO4-/H+共转运子,该家族主要成员在植物根系中负责磷的吸收和转运,其表达受磷调控,对该家族成员的研究有助于揭示磷的吸收和转运机制。根据Pht1家族基因的保守性设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了1个Pht1基因,命名为HbPht1。氨基酸序列同源性比对与系统进化分析表明,HbPht1属于磷转运蛋白基因家族的新成员。该基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础。     

巴西橡胶树HbHEX1基因的克隆及表达分析

根据一个巴西橡树胶乳cDNA文库中的EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码homeobox蛋白的cDNA(命名为HbHEX1)。序列分析结果表明,HbHEX1长为1612bp,含有873bp的阅读框,292bp的5'-UTR和447bp的3'-UTR,编码290个氨基酸,分子量为33.02KD,等电点为6.35,含有保守的homomeodomain,属于HD-ZIP类。该氨基酸序列与蓖麻、马铃薯、胡萝卜的同源异型盒蛋白的同源性分别为92%、77%和72%。半定量RT-PCR分析结果表明HbHEX1基因在花和愈伤组织中基本上没有表达,在体细胞胚、芽、叶、胶乳和树皮中有表达,其中在胶乳中表达量最高。     

转移巴西橡胶树HbCBF1基因提高烟草抗寒能力的研究

通过农杆菌介导的叶盘转化法将巴西橡胶树HbCBF1基因导入到烟草中增强表达。GUS染色和PCR鉴定结果表明,外源DNA片段已成功导入并整合到烟草基因组中。选取3个烟草转基因株系用于进一步鉴定分析,分析表明,转化植株游离脯氨酸含量与对照相比,分别上升了4.2倍、3.1倍和2.5倍,叶绿素A和叶绿素B含量也明显提高。电导率法测定转化烟草的相对存活率分别为19.8%、17.5%、16.3%,高于对照植株的7.7%。以上结果表明,橡胶树HbCBF1基因能够增强非低温驯化植物烟草的抗寒能力,其机理可能是通过促进细胞内容物的积累从而提高细胞的低温防御能力。     

巴西橡胶树HbHDT1基因的克隆及表达分析

根据一个已获得的在巴西橡胶树幼态无性系与老态无性系之间差异表达的SSH片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得橡胶树编码组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase)的cDNA(命名为HbHDT1)。序列分析结果表明,HbHDT1长为1197bp,含有917bp的阅读框,86bp的5'-UTR和196bp的3'-UTR,编码304个氨基酸。该氨基酸序列与蓖麻、毛果杨、马铃薯、红花苜蓿、大豆、小麦的HDACs家族成员的同源性分别为65%、59%、50%、45%、43%和40%。半定量RT-PCR分析结果表明HbHDT1在巴西橡胶树的花、愈伤组织、胚、叶、芽、胶乳中均有表达。在体细胞胚发生过程中HbHDT1表达出现明显的差异,在培养12d的体细胞胚中表达量最低,在培养53d的体细胞胚中表达量最高。茉莉酸和乙烯处理对胶乳中HbHDT1的表达无影响。     

巴西橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因的克隆及序列分析

根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3’-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbLEA14基因的全长cDNA序列,其ORF长456 bp,编码151个氨基酸,预测HbLEA14蛋白分子量为16.58 ku,等电点为5.10。同源性比对显示,HbLEA14与蓖麻RcLEA14、乳浆大戟EeLEA14、陆地棉GhLEA14、大豆GmLEA14、拟南芥AtLEA14、番茄SlER5的同源性分别为88%、80%、75%、73%、65%和61%,属于非典型第2组LEA蛋白。RT-PCR结果显示,死皮植株胶乳中HbLEA14的表达量明显高于健康树。     

巴西橡胶树SUMO活化酶基因HbSAE1的克隆及表达

根据一个从巴西橡胶树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码SUMO活化酶(SUMO-activating enzyme,SAE)的cDNA,命名为HbSAE1。序列分析结果表明HbSAE1长为2 411 bp,含有1917 bp的阅读框,214 bp的5'-UTR和280 bp的3'-UTR,编码638个氨基酸,分子量为70.79 ku,等电点为5.41。半定量RT-PCR分析结果表明HbSAE1基因在花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最高。     

巴西橡胶树脱水素基因HbDHN2的克隆及其氨基酸序列分析

脱水素(dehydrin,DHN)是存在于植物体内高度亲水的一类蛋白质,在植物响应和适应干旱、低温和盐渍等非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究在橡胶树已有转录组测序组装序列(TSA)数据的基础上,通过RT-PCR方法克隆了一个新巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)脱水素基因HbDHN2,并分析其氨基酸序列。结果表明,HbDHN2含210个氨基酸残基,与HbDHN1同为SK2型酸性脱水素,属于优先响应低温胁迫的脱水素类型(SKn)。     

巴西橡胶树胶乳亮氨酸氨肽酶基因克隆及表达

以巴西橡胶树(Hevea Brasiliensis)无性系热研7-33-97的胶乳为材料,根据已报道的植物亮氨酸氨肽酶基因的保守序列设计简并引物,应用RACE技术克隆同源基因(HbLAP1).用生物信息学软件(DNA-MAN,DNAStar,ScanProsite,ClustalW)对HbLAP1进行生物信息学分析,通过Northern-blot分析HbLAP1的表达.结果表明,HbLAP1的cDNA全长1 985 bp,包括1个1 581 bp的阅读框,编码526个氨基酸的蛋白质,一个105 bp的5'非编码区和一个299bp的3'非编码区(括16个腺苷酸尾巴);HbLAP1是一种可溶性的细胞质氨肽酶结构域,割胶显著下调舶HbLAP1的表达.HbLAP1可能是乳管细胞茉莉酸信号途径的负调控因子.     

巴西橡胶树6个蔗糖转运蛋白基因的克隆与序列分析

蔗糖是绿色植物光合作用同化碳的主要运输形式,而蔗糖的跨膜运输是由蔗糖转运蛋白(SUT)所介导完成的。通过简并性RT-PCR和RACE技术,笔者首次从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了6个SUT基因的全长cDNA,分别命名为HbSUT1、HbSUT2A、HbSUT2B、HbSUT3、HbSUT4和HbSUT5,相应序列已在GenBank上登录(登录号分别为DQ985466、DQ985467、DQ985465、EF067334、EF067335和EF067333)。氨基酸序列的同源性比对与系统进化分析表明,所得到的6个HbSUT基因可分为3个亚类,分别被聚为双子叶植物SUT基因的3种类型,即SUT1-type、SUT2-type和SUT4-type。在所分析的39种植物SUT基因中,HbSUT基因与同为大戟科的木薯、蓖麻和乳浆大戟SUT基因的同源性最高,反映这些基因的系统进化与物种进化的一致性。本文为进一步研究橡胶树SUT基因的功能奠定了基础,并将有助于巴西橡胶树中不同库组织,尤其是乳管的蔗糖供给与调控分子机理的阐明。     

巴西橡胶树HbMlo9基因克隆及其序列特征分析

Mlo基因是一类重要的抗病基因,该基因的隐性突变可赋予植物广谱持久的抗病性。本研究以葡萄Mlo9(VvMlo9)基因为探针对巴西橡胶树的EST和转录组数据库进行同源搜索,并将获得的同源EST序列进行拼接,得到巴西橡胶树Mlo9基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了橡胶树的Mlo9基因,并命名为HbMlo9。序列分析结果表明,该基因的开放阅读框(ORF)为1 725 bp,编码574个氨基酸,分子量为65.35 ku,等电点为8.93。对HbMlo9蛋白结构域的分析结果发现,该蛋白具有Mlo保守结构域,包含9次跨膜结构和1个典型的N端信号肽。系统进化关系分析结果发现,Mlo是1个比较保守的蛋白家族,HbMlo9与蓖麻Mlo同源性最高,达到88%,其次是桃Mlo(79%)和葡萄VvMlo9 (78%)。本研究为验证该基因在巴西橡胶树抗病中的功能奠定基础。     

巴西橡胶树ADF6基因的克隆与表达分析

肌动蛋白解聚因子(Actin Depolymerizing Factor,ADF)是一种重要的肌动蛋白结合蛋白。ADF通过参与调控肌动蛋白的装配和解聚在多种生理过程中发挥重要作用。本研究通过RT-PCR技术从橡胶树胶乳中获得HbADF6基因的cDNA和基因组序列,序列分析显示HbADF6基因的开放阅读框为441 bp,共编码146个氨基酸,基因组序列由2个内含子和3个外显子组成。实时荧光定量PCR结果表明,HbADF6基因在所有检测组织中均表达,其中树皮中表达量最高,叶片中表达量最低。HbADF6基因的表达受乙烯利(ET)和碘化钾(KI)调控,并与排胶时间和死皮有关。此结果表明HbADF6基因可能在橡胶树乙烯响应、死皮和排胶过程中发挥重要作用。      

‘海贡蕉’引种试种研究

对引进的二倍体香蕉‘Pisang Empat Puluh Hari’进行品种资源评价,鉴定出该品种天然高抗香蕉枯萎病4号小种,对香蕉枯萎病1号小种免疫, 2013年被海南省农作物品种审定委员会认定名‘海贡蕉’。该品种在栽培香蕉中生育期最短、外观好、收购价格高、受市场欢迎,在枯萎病区栽培经济效益好。根据该品种制订其配套的栽培技术措施,在海南、广东经多年品试、中试和推广,目前已开发成为国内唯一高抗香蕉枯萎病4号小种纯A基因的商业香蕉品种。     

巴西橡胶树HbRPW8基因克隆与表达分析

RPW8（resistance to powdery mildew locus 8）是对植物多种病害,尤其白粉病具有抗性的广谱抗病基因位点,通过对橡胶树RPW8基因进行克隆及表达分析,为橡胶树抗白粉病机制解析和分子育种等方面打下基础。以橡胶树‘热研73397’为材料,采用RT-PCR克隆HbRPW8基因编码区（CDS）序列;对其进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR方法,测定7种激素和白粉菌侵染不同时间、不同病害等级处理后RPW8基因表达量。该基因cDNA全长570 bp,编码189个氨基酸,该蛋白的分子量为21.73 kDa,等电点为9.23,脂肪系数为86.30,总平均亲水性指数为-0.404,为亲水性蛋白,共有8个磷酸化位点,无跨膜域和信号肽,定位于细胞核,具有RPW8的保守结构域,α-螺旋和无规则卷曲是HbRPW8蛋白二级结构的主要元件,分别占氨基酸序列的70.90%和22.22%。亲缘关系显示,HbRPW8基因与木薯RPW8基因相似性最高。过氧化氢（H₂O₂）、水杨酸（SA）、乙烯利（ETH）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）能迅速诱导HbRPW8转录本的表达,并在处理后0.5 h达到最高水平,分别约为对照的14倍、6倍、75倍、2.5倍和4倍;茉莉酸甲酯（MeJA）处理后6 h达到最高水平,是对照的10倍左右;生长素处理后HbRPW8转录本显著下调;随着白粉菌侵染时间和病害等级的增加,HbRPW8的表达量均呈现先上升后下降的趋势。研究结果初步表明,HbRPW8可能参与橡胶树的抗病反应机制,为橡胶树抗病育种的研究提供参考。     

橡胶树HbPIP1;1基因的克隆及蛋白的亚细胞定位与多聚化分析

水通道蛋白（aquaporin）是一类广泛存在生物体中高效转运水分子的膜内在蛋白,其在生物膜上以同源或异源四聚体的形式起作用。根据序列相似性及亚细胞定位,植物水通道蛋白可分为PIP （plasma membrane intrinsic protein）、TIP（tonoplast intrinsic protein）、NIP（NOD26-like intrinsic protein）、SIP（small basic intrinsic protein）和XIP（X intrinsic protein）等5大类,其中,PIP定位在细胞膜,是介导细胞间水分跨膜运输的主要通道。橡胶树最早起源于南美亚马逊河流域,是目前天然橡胶的主要商业来源。与其他植物相比,橡胶树除蒸腾耗水外,周期性的割胶活动也会造成水分的大量流失,因此,水分平衡对于橡胶树尤为重要。为揭示橡胶树水分平衡的分子机制,采用RT-PCR技术对1个PIP类水通道蛋白基因HbPIP1;1进行克隆,并在此基础上对其编码蛋白的亚细胞定位和多聚化特征进行分析。结果显示：该基因的编码区长864 bp,预测编码287 aa,其理论分子量为30.80 kDa、等电点8.59、不稳定系数49.27、脂肪族指数22.34、总平均疏水指数为0.639,属于不稳定的疏水型碱性蛋白;蛋白含有水通道蛋白家族特有的MIP（major intrinsic protein）结构域及6个典型的跨膜螺旋,每个螺旋的残基数介于20~23之间。研究构建了基因的亚细胞定位分析载体,并采用农杆菌介导法对烟草叶片进行了瞬时转化。荧光共聚焦显微镜观察显示,HbPIP1;1蛋白定位在细胞膜,与用生物信息学手段预测的结果一致。在烟草叶片中的双分子荧光互补实验显示,HbPIP1;1蛋白自身不能互作,这进一步得到了点对点的酵母双杂交实验的证实。以上结果表明HbPIP1;1蛋白可能通过异源互作的方式参与橡胶树水分的平衡。