一株Asia 1型口蹄疫病毒的全基因组序列测定及比较分析

参考GenBank上已发表的口蹄疫病毒（FMDV）全长基因组序列,设计了覆盖基因组全长的数对引物,通过RT-PCR方法对1株Asia1型（简称As01）FMDV进行分段克隆及序列测定,将测序结果利用软件进行拼接。结果表明,该毒株的FMDV基因组[不合poly（C）]全长8180nt,其中编码区为6987nt,5’和3’非编码区（UTR）分别为1078nt和95nt,3＇UTR之后为20nt的poly（A）尾巴。将As01株与其他FMDV参考毒株利用分子生物学软件进行多序列比对分析表明,As01株与Asia 1／Jiangsu／China／2005、Asia 1／Isr 1／3／63、ZB／CHA／58等Asia 1型FMDV遗传进化关系较为密切,而与O型和A型FMDV遗传关系较远。     

猪O型口蹄疫病毒强弱毒株VP1基因的克隆与序列分析

本研究根据口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因的序列，设计并合成了1对用于扩增整个VP1基因的引物（5P、P6）。从细胞培养液或组织中提取总RNA，通过PT－PCR扩增，从F29株O3I3株和T509株中均获得了1条约740bp的DNA电泳带。将PCR产物双酶切后电泳回收，插入到相应双酶切的pUC18质粒中，获得了重质粒。通过PCR鉴定，证明重组质粒pUCVP1/F29,pUCVP1/0313,pUCVP1/T509均插入了VP1基因。对上述3个重线质粒进行测序后分析，F29强毒株与O313、T509弱毒株相比，其核苷酸序列同源性分别为98．75％和99．06％；因F29株核苷酸发生3个碱基缺失与1个碱基替换，故推导的氨基酸序列同源性分别仅为44．13％和41．32％，而T509和O3I3株相比，其核苷酸、氨基酸序列同源性分别为99．37％和95．31％。通过序列分析发现，本研究的3个毒株与国内大多数毒株（包括1997年台湾暴发FMDV所分离的毒株，除O／A／58株外）均属同一基因型，核苷酸序列同源性为85％－94％；而与国外毒株相比，属不同的基因型，核苷酸序列同源性仅为81％－82％，其推本研究的3个毒株与国内分离的大多数毒株的VP1基因的氨基酸序列同源性高达87％－95％，本项研究对猪O型FMDV的强弱毒株VP基历进行克隆与序列分析，将进一步丰富我国FMDV毒株VP1基因资料库，为更加科学地防制FMD提供分子水平依据。     

口蹄疫OX株全基因组cDNA的分子克隆、序列测定及分析

采用RT-PCR法对FMDV OX株基因组全序列进行了分子克隆与测序。结果表明不含poly(C)序列和poly(A)尾巴的OX株基因组全序列长8104nt,开放读码框(ORF)长6969nt、编码2322aa,5’UTR长1040nt,3’UTR长95nt。应用分子生物学软件将OX株与FMDV其它参考毒株进行序列比较,并对其基因特征进行分析。结果显示,OX株与OTwyl／97的核苷酸同源性最高,在基因组功能未知区和3A编码区具有两处明显的缺失现象,其一是在3A编码区有30nt的连续缺失,这与OTwyl／97株相同,其二是在功能未知区域有44nt的缺失,这与OTwyl／97株相同,与OAkesu58相似(43nt缺失)。     

口蹄疫病毒Akesu／O／58株结构蛋白基区的克隆和细胞受体结合位点初探

将Akesu／O／58口蹄疫病毒分离株牛舌皮毒适应乳鼠，通过RT—PCR法分别获得了该病毒结构蛋白基因vp1和p1。结果表明：vp1和p1基因分别为639bp和2208bp，与Akesu／O／58细胞适应株FMDV的vp1和声1基因核苷酸序列的同源性分别为83．9％和84．7％，氨基酸序列的同源性为89．7％和95．1％。本试验分离株与OHK99、O1K、Taiwan97病毒株的细胞受体结合位点均为RGD（Arg-Gly-Asp），而Akesu／O／58细胞适应株的细胞受体结合位点为SGD（Ser-Gly-Asp）。     

口蹄疫病毒3ABC基因的克隆与测序

参考 Gen Bank中发表的猪源 O型口蹄疫病毒 3 ABC的基因序列 ,设计一对特异引物 ,以猪源 FMDV/ O/ CC株基因组 RNA为模板 ,RT-PCR扩增 3 ABC基因 ,并克隆到 p MD1 8-T载体中。测序结果显示 ,FMDV/ O/ CC株 3 ABC基因 c DNA长 1 2 81 bp,编码为 42 7个氨基酸残基组成的多肽。核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性比较发现 ,FMDV/ O/ CC株和 FMDV/O/ TW/ 99株 3 ABC基因亲缘关系密切。核苷酸同源性为 97% ,推导氨基酸序列同源性为96.3 %。     

含74个腺嘌呤poly（A）尾的猪水泡病病毒HK／70株3’非编码区的克隆及其特征分析

应用3’RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒（SVDV）HK／70株基因组3’端的真实序列。测序结果表明，所扩增的目的基因片段长4200nt，包括非结构蛋白编码区（P2和P3）、3’端非编码区和poly（A）尾，其中3’NTR位于终止密码子TAA之后，长99nt，poly（A）至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较，结果显示，HK／70株与J1’73、H／3’76和AUG／22／90株的核苷酸同源性较高，为99．0％（仅第65位碱基不同），而与NET／1／92参考毒株的核苷酸同源性较低，为83．3％，与人柯萨奇病毒B5UK／54株（UK／54-CB5）的同源性为75．7％。同时对3’NTR的二级结构进行分析，并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明，它们具有协同变异性，有共同的祖先，显示出3’NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。     

用3''RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3''末端序列

应用3’RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒(FMDV)0H99株基因组3’端真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长1500nt,包括3D基因部分序列、3’端非编码区(Non—Coding Region,NCR)和Poly(A)尾巴,其中3’NCR位于终止密码子TAA之后,长93nt,Poly(A)尾序列至少含有56个A。与参考毒株进行序列比较,结果显示,OH99株与0TY TW／97株的核苷酸同源性较高,为91．4％,而与O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低,其同源性分别为68．1％、71．0％、70．2％。3’NCR的末端存在保守性较高的基序：CCCTCAGATG,TTTTCCC—CGCTTCCT。本研究为进一步研究FMDV基因组的功能、构建OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。     

新城疫病毒Lasota株F基因的克隆和序列分析

本试验采用RT-PCR方法对NDV Lasota株的全长F基因进行了扩增与克隆，并对其进行测序。扩出的F基因核苷酸长度为1664bp，单一的开放阅读框编码553个氨基酸的长肽，序列中有6个糖基化位点，13个半胱氨酸残基，包括完整的F1片段和完整的F2片段。裂解位点区(112-117aa)氨基酸序列为Gly-Arg-Gin-Gly-Arg-Leu，与所有弱毒株在这一区域的序列(Gy-Arg／Lys-Gin-Gly／Ser-Arg-Leu)相符。同源性分析表明，Lasota株F基因与已发表的其它NDVF基因相比，核苷酸序列同源性在88％-99％之间，推导的氨基酸序列同源性在90％～99％之间。     

伪狂犬病病毒Fa株gp63（gI） 基因核苷酸序列测定及分析

对我国最早分离的伪犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)Fa株糖蛋白gp63(gI)基因核苷酸序列及的氨基酸序列作了测定与分析，完整的gp63(gI)结构基因从起始密码子ATG到终止密码子TGA共有1050个核苷酸残基，编码由439个氨基酸残基构成的多肽链，4种核苷酸残基的构成比分别为：G35．9％，11.33%,T11.81%,C40.95%,G C含量达76．85％，PRV Fa株gp63基因核苷酸序列与Nice株的相比，两者同源性达98．13％，仅存在3个核苷酸残基的缺失变异，氨基酸推导序列分析表明，糖蛋白gp63具有典型膜蛋白特征，与Nice株相比，同源性为97．42％，gp63基因起始密码子由3个连续的ATG组成，ATG上游区域内无启动子调控区序列。     

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)HK’70为材料，用特异性引物扩增出P1区的2个重叠目的片段，连接于pMD18-T载体，转化JM109感受态细胞。经重组质粒的双酶切，PCR鉴定后测序。序列分析表明，HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高，G C含量较低，且A-G、C-T转换率较高。P1序列同源性分析表明，SVDV HK’70与J1’73、H／3’76、SVDV(Seechurn等测株)、NET／1／92的核苷酸序列同源性分别为97．8％、98．1％、97．6％和89．3％；相应地，推导的氨基酸序列同源性分别为98．8％、98．7％、98．8％和96．5％。     

用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。     

5株口蹄疫病毒VP1和3A基因的序列分析

为了解广东地区口蹄疫病毒(FMDV)遗传进化情况,本研究从广东采集5份疑似FMDV感染病料,对样品进行RT-PCR扩增,经克隆测序后,对FMDVs基因序列比对和遗传进化分析。鉴定结果显示,这些病料样品中2份为O型FMDV感染,3份为A型FMDV感染。2个FMDV O型样品中VP1基因的全长均为639 bp,编码213个氨基酸,3A基因的全长均为459 bp,编码153个氨基酸;3个FMDV A型样品中VP1基因的全长均为636 bp,编码212个氨基酸。3A基因的全长均为459 bp,编码153个氨基酸;与国内外分离的O/A型病毒株VP1基因核苷酸序列相比较发现,2个O型病毒VP1基因与O/BY/CHA/2010株核苷酸序列相似性最高(95.0%),均属于耿马谱系FMDV(属ESA基因型);3个A型病毒VP1基因与A/GDMM/CHA/2013株核苷酸序列相似性最高(99.2%),均属于Asia型FMDV。本研究通过对FMDV遗传进化分析为我国FMDV流行病学的研究提供了基础数据,同时对临床上不同型疫苗的选择提供依据。     

马立克氏病病毒不同致病型meq基因的比较研究

为了研究马立克氏病病毒（MDV）的meq基因与不同毒株致病性的关系，应用PCR技术扩增了不同致病型MDV毒株的meq基因，测定和比较了它们的核苷酸和氨基酸序列。这些毒株包括：国际通用Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒814株、强毒GA株（vMDV)、特超强毒648A株（vv MDV)以及6个广西分离到的野毒株。结果发现，MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守，它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均在95.6%-99.7%。但是，与所有测试的致病性MDV毒株相比，二个Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和814株均在阅读框的核苷酸序列中缺失第575-577位3个碱基（CAC），导致一个氨基酸（脯氨酸）的缺失。该缺失性突变恰恰位于meq基因的多脯氨酸功能的一个重复序列（EELCAQLCSTPPPPI）之中。该缺失性突变与一个疫苗毒株失去致肿瘤性是否有关，还有待进一步研究。     

国产IBV疫苗株膜蛋白基因的亲缘关系研究

利用自行设计的引物Wx和Ws，通过RT－PCR方法分别扩增出IBVD41株、H120GD株、H120SH株、H520GD株4个国产疫苗株和标准强素M41－E4株完整的M基因cDNA，然后将其分别克隆到pGMET－Easy或pMD18－T载体中。测序结果发现：这5个IBV毒株的M基因均为678bp，分别编码由225个氨基酸残基组成的多肽。序列分析表明：D41株、H120GD株和H120SH株M基因之间的核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性均为100％，它们在系统发生进化树中处同一分支；而H52GD株和国内的M41－E4株和国外的M41株M基因之间的核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别为99．9％和99．6％，它们之间的亲缘关系最近，在系统发生进化树上处另一个分支。     

口蹄疫病毒Hankou/99株基因组全序列测定与基因特征分析

本研究主要对口蹄疫病毒(FMDV) Hankou/99株全基因序列进行测定,通过基因序列分析,确定其基因型,丰富了FMDV基因库,为研究猪源FMDV的分子变异、感染性分子克隆及致病机理奠定基础.从感染FMDV Hankou/99株的细胞液中提取RNA,通过RT-PCR技术,获得猪FMDV Hankou/99分离株覆盖全基因组的5个cDNA片段(S、L、C、D、E),分别对这些片段进行克隆和序列测定.结果显示,FMDV Hankou/99株全基因组长8099 bp;5'NCR长1040 bp,开放阅读框长6966 bp;3'NCR长93 bp,其后是30个碱基的连续poly(A)结构.通过与参考株基因组结构比较分析,显示其在分类地位上属于O型FMDV,并与猪源FMDV毒株OLZ、TW/97同源性较高,特别是3A区域上都有30 bp的缺失.另外,通过与9个参考株的VP1系统发生树分析,显示其与OLZ、TW/97、O/Akesu/58、O/OMⅢ 4个毒株为同一基因型.     

口蹄疫病毒Akesu/O/58株结构蛋白基因的克隆和细胞受体结合位点初探

将Akesu/O/58口蹄疫病毒分离株牛舌皮毒适应乳鼠,通过RT-PCR法分别获得了该病毒结构蛋白基因vp1和p1.结果表明:vp1和p1基因分别为639 bp和2 208 bp,与Akesu/O/58细胞适应株FMDV的vp1和p1基因核苷酸序列的同源性分别为83.9%和84.7%,氨基酸序列的同源性为89.7%和95.1%.本试验分离株与OHK99、O1K、Taiwan97病毒株的细胞受体结合位点均为RGD(Arg-Gly-Asp),而Akesu/O/58细胞适应株的细胞受体结合位点为SGD(Ser-Gly-Asp).     

伪狂犬病病毒Ea株gM和gN基因的克隆与结构分析

gM和Ng是最近经经典免疫沉淀法确定的伪狂犬病病毒（PRV）第三对异源糖蛋白二聚体。根据PRV国外Ka株的核苷酸序列，设计两对分别包含gM和Ng完整编码的特异性引物，以PRV国内地方分离株（Ea株）的细胞感染物为模板，PCR扩增出大小约1．2kb和0．3kb的特异性片段。将扩增物克隆到杆状病毒转座载体pEastBacl中，酶切鉴定证实后进行序列测定。结果表明：Ea株gM、Ng基因分别编码394和98个氨基酸，与Ka株的同源性分别为98．4％和97．6％。DNATool和DNASIS软件对gM、Ng进行二级结构预测，发现gM存在8个潜在跨膜区和一个N－糖基化位点，是典型的能反复多次跨膜的Ⅲ型糖蛋白；gN具有N－端信号肽序列、C－端跨膜区和潜在0－糖基化位点，属Ⅰ型糖蛋白。上述结果为下一步深入研究gM、Ng的相互作用位点及二聚体的功能奠定了功能。     

黑龙江省和河北省鸡新城疫病毒分离株的遗传变异分析

利用RT—PCR技术扩增出了4株NDV分离株(HeB—4—99，Hed—5—99、HeB—6—02和HLJ—10—02)F基因539bp的片段，将该片段克隆到pMD18-T载体上。经酶切分析、质粒PCR鉴定及核苷酸序列测定，成功获得了4株NDV分离株F基因部分片段的重组质粒。同源性分析显示，4株分离毒株的核苷酸序列具有95．9％～100％的同源性，与LaSota的核苷酸序列同源性为81．09／6～81．8％，与F48E9的核苷酸序列同源性达85．8％～89．3％。推导氨基酸序列分析表明，4个毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为^112RRQKRF^117，具有强毒株裂解位点氨基酸组成特点，与ICPI和MDT测定结果相吻合。73株NDV毒株的系统发育进化树分析表明，HeB—4—99、HeB—5—99、HeB—6—02和HLJ—10—02均归属于基因Ⅶ型。     

鸡新城疫云南分离株HN基因序列测定和分析

用RT—PCR法对分离自云南省的2株鸡新城疫病毒(编号YN—C1、YN—C2)进行HN基因的扩增和克隆．并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明：2毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为l716nt；二者之间的核苷酸同源性为95．3％，氨基酸同源性为95．8％；YN—C1毒株与参考毒株GD／1／98／Go核苷酸、氨基酸同源性均最高，分别为97．9％和97．6％；YN—C2毒株与参考毒株JS／5／01／Go核苷酸同源性最高为98．5％，而与参考毒株JS／3／98／Go氨基酸同源性最高为98．1%。     

猪水泡病病毒非结构蛋白编码区的克隆与序列分析

以猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)HK’70为材料，用特异性引物扩增出非结构蛋白编码区的4个重叠目的片段，连接于pMD 18-T载体，转化JMl09感受态细胞。经对重组质粒双酶切、PCR鉴定、序列分析表明，HK’70非结构蛋白编码区核苷酸长4002nt，氨基酸长1334aa；与J1’73、H／3’76、SVDV(Seechrn等测株)、NET／1／92的核苷酸同源性分别为98．6％、98．3％、98．3％、91．2％，推导氨基酸序列的同源性分别为98．9％、99．1％、99．2％和97．2％。