蚊耐氯菊酯C6/36细胞构建及耐药相关基因PR-XP1的表达分析

建立蚊耐氯菊酯C6/36细胞,并探讨PR-XP1基因与蚊C6/36细胞对氯菊酯的耐药性之间关系.采用逐步诱导法筛选蚊耐氯菊酯C6/36细胞,观察耐药细胞形态变化、生长状态,测定生长曲线和半数致死剂量;利用荧光实时定量PCR鉴定PR-XP1基因在敏感细胞与耐药细胞中的表达差异.获得耐400μg/mL氯菊酯的C6/36细胞;实时定量PCR检测发现抗药基因PR-XP1在蚊耐氯菊酯C6/36细胞中表达量明显上升.表明构建蚊耐氯菊酯C6/36细胞是研究蚊虫氯菊酯耐药性的有效方法,初步证明PR-XP1基因表达升高可能与蚊虫对氯菊酯的耐药性具有一定的相关性.     

玉米ZmPP2C6-01基因的克隆及表达分析

为了研究玉米蛋白磷酸酶2C (PP2C)基因对非生物胁迫的响应及生理功能,以耐旱玉米自交系豫882为试验材料,对玉米20%PEG6000胁迫处理转录组进行分析,筛选受干旱诱导强烈表达的PP2C基因,然后对其进行克隆、生物信息学分析及表达模式分析。结果表明,在玉米20%PEG6000胁迫处理转录组中筛选到一个干旱胁迫下显著上调表达的PP2C蛋白基因,命名为ZmPP2C6-01。ZmPP2C6-01基因的开放阅读框为1 242 bp,编码413个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为43.8 ku,等电点为6.6,是一种亲水性蛋白。ZmPP2C6-01蛋白与高粱的PP2C蛋白亲缘关系最近,而与冬小麦、粗山羊草等的PP2C蛋白亲缘关系相对较远。ZmPP2C6-01蛋白定位于细胞核中。利用实时荧光定量PCR分析发现,ZmPP2C6-01基因在玉米根中的表达量最高,其次是叶,茎中最低;PEG胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中的表达量大部分时间点均高于对照,同时在叶中呈上调表达模式;在ABA、NaCl、高温胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中大部分时间点的表达量均低于对照,整体呈下降趋势,而在叶中的表达量均高于对照,呈上调表达模式。综上表明,ZmPP2C6-01基因响应干旱等逆境胁迫,但表达模式不一致。     

‘库尔勒香梨’PsiCAD1和PsiPRX6基因的亚细胞定位和表达分析

石细胞含量的多少是影响梨果实口感关键因素之一,而木质素是梨石细胞的主要组成成分,肉桂醇脱氢酶(CAD)和过氧化物酶(PRX)是合成木质素关键的酶。为了探索CAD和PRX基因在‘库尔勒香梨’石细胞发育过程中的作用,本研究以‘库尔勒香梨’为试验材料,测定梨果实石细胞含量与木质素含量,并运用亚细胞定位与瞬时表达技术进行PsiCAD1和PsiPRX6的功能验证。结果表明‘库尔勒香梨’果实石细胞含量与木质素含量在30～80 DAF呈先上升后下降的趋势,同时通过RT-qPCR发现PsiCAD1、PsiPRX2、PsiPRX6与PsiPRX17不同时期的表达量与果实石细胞含量和木质素含量发育趋势一致;通过亚细胞定位技术发现Psi CAD1-GFP与PsiPRX6-GFP融合蛋白荧光信号在细胞膜中表达,推测该蛋白激酶合成后可能在质膜上发挥作用;在梨果中瞬时表达过表达载体中发现PsiPRX6、PsiCAD1过表达下观察到木质素染色与含量均增加,且注射位点的PsiCAD1与PsiPRX6的表达量也有所增加。上述结果初步表明PsiCAD1与PsiPRX6基因参与调控木质素的合成,为进一步了解木质素合成和细胞...     

致病疫霉木瓜蛋白酶亚家族基因C1A-PH-SCH1的克隆与表达分析

为进一步明确引起马铃薯晚疫病的致病因子,通过克隆马铃薯晚疫病致病疫霉菌分泌蛋白中的半胱氨酸蛋白酶家族基因,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达。本试验采用TA克隆法,提取来自云南马铃薯产区的致病疫霉菌XH05-5-4的总RNA,反转录cDNA,PCR扩增后将该基因片段连接到载体,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。克隆获得半胱氨酸蛋白酶家族基因全长为1176 bp,包含1个最大的开放阅读框1077 bp,编码387个氨基酸。推测蛋白相对分子量41.671 kD,理论等电点4.88;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的蛋白与预期蛋白相符合。生物活性测定表明：马铃薯叶片出现坏死,类似于晚疫病症状。利用TA克隆技术从致病疫霉菌XH05-5-4中克隆得到了1个半胱氨酸蛋白酶家族基因（登录号：KP938956命名：C1A-PH-SCH1）,通过同源性比对发现C1A-PH-SCH1为木瓜蛋白酶亚家族基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了表达,对生物活性测定结果显示出现了类似于晚疫病症状的水渍坏死斑症状,推测C1A-PH-SCH1参与马铃薯晚疫病的发病过程。     

拟南芥抗病相关基因T1N6_22的原核表达分析

为构建拟南芥抗病相关T1N6_22基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的T1N6_22蛋白,以拟南芥Col-0的c DNA为模板,扩增获得了T1N6_22基因CDS,对其进行克隆、测序后与含有GST标签蛋白的p GEX4T-1载体相连,构建T1N6_22的原核表达载体p GEX4T-1-T1N6_22-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的载体及空载体转化大肠杆菌BL21。结果表明,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的T1N6_22蛋白,大小约57 k Da。SDS-PAGE分析表明,高效表达的诱导条件为0.1 mmol/L IPTG诱导培养3 h。研究结果为进一步T1N6_22互作蛋白的筛选及其调控拟南芥抗病分子机制的研究奠定了基础。     

靶向马铃薯StProDH1基因的CRISPR/Cas9 sgRNA表达载体构建

CRISPR/Cas9基因编辑系统已成为许多作物基因功能研究和品种改良的重要工具。脯氨酸(Pro)在植物响应干旱胁迫方面起着重要作用,脯氨酸脱氢酶ProDH是脯氨酸分解途径中的限速酶。为了研究StProDH1在马铃薯脯氨酸代谢中的作用,本研究以StProDH1为靶基因,构建了表达马铃薯脯氨酸脱氢酶g RNA的CRISPR/Cas9基因敲除系统,在StProDH1基因5'端第一个外显子上为靶标区域选择设计sgRNA,以p P1C.4为模板,克隆得到sgRNA克隆框,将得到的sgRNA克隆框通过同源重组技术连接到pP1C.4载体中,获得pP1C.4-Cas9-ProDH1-g RNA载体。通过设计引物特异性扩增以及测序进一步确定sgRNA准确地连入载体,这对马铃薯中脯氨酸累积及其培育抗旱马铃薯新品种具有重要意义。     

中间锦鸡儿CiATAF1基因的亚细胞定位及表达分析

为研究NAC转录因子在非生物胁迫条件下的表达,以中间锦鸡儿为材料,克隆并分析了NAC转录因子家族CiATAF1基因。该基因ORF全长为873 bp,编码291个氨基酸,由2个内含子和3个外显子构成,具有典型NAC结构域。染色体步移法获得CiATAF1基因启动子826 bp,该启动子含有光、激素、厌氧诱导等多种响应元件。经拟南芥叶片原生质体瞬时表达分析亚细胞定位,CiATAF1基因主要定位于细胞核中。荧光定量分析表明:CiATAF1基因表达具有组织特异性,相比于中间锦鸡儿根和茎,在叶部表达量最高;在干旱、盐、冷、ABA处理下,CiATAF1基因表达量增加,推测该基因可能与非生物胁迫应答相关。CiATAF1同模式植物拟南芥及豆科其他植物的同源基因做多重序列分析,序列一致性为81.14%,表明ATAF1基因序列结构相对保守。生物信息学分析CiATAF1蛋白质属于不稳定的亲水蛋白,二级结构主要由α-螺旋、β折叠、无规则卷曲构成。研究结果对挖掘中间锦鸡儿抗非生物胁迫的基因和深入分析逆境胁迫机理具有重要意义。     

大葱雄性不育系及保持系atp6基因的克隆及表达分析

为进一步研究atp6基因与大葱细胞质雄性不育的关系,以章丘大葱不育系和保持系作为本研究的实验材料,利用同源克隆的方法获得大葱atp6基因序列,并对其在蛋白质二级结构和生长发育各时期atp6基因表达量进行了比较.结果表明:不育系与保持系atp6基因开放阅读框第171碱基处存在一个A/T多态性位点,这一多态性位点使蛋白质二...     

野生番茄SpIDD1基因的表达分析及其VIGS载体构建

为鉴定野生番茄的SpIDD1基因并探究其功能,以野生醋栗番茄‘PI365967’为试验材料,利用RT-PCR克隆得到SpIDD1基因的CDS序列,全长1 020 bp,编码339个氨基酸,与普通番茄参考基因组序列相比,SpIDD1只存在一个核苷酸位点的差异。蛋白序列比对和结构分析表明,Sp IDD1含有1个核定位信号和4个保守锌指结构域(C2H2·C2H2·C2HC·C2HC),是一个典型的IDD蛋白。系统进化分析表明,SpIDD1与马铃薯和辣椒的IDD蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR显示,SpIDD1在叶、顶芽和果实中的表达较高,并受干旱胁迫的显著诱导。利用TRV-VIGS系统构建了Sp IDD1的基因沉默载体,并成功侵染番茄。研究结果表明,SpIDD1作为一个典型的IDD基因,很可能参与了番茄的干旱胁迫。本研究为进一步研究该基因的功能及作用机理提供理论依据。     

小麦细胞分裂素受体基因TaHK1的生物信息学及表达特性分析

细胞分裂素在植物发育和应对盐渍、干旱等非生物胁迫的过程中均扮演着重要的角色。为了研究小麦细胞分裂素受体基因的功能,利用已知的拟南芥细胞分裂素受体基因AHK4(At2g01830)为参考序列,使用同源克隆的方法从小麦基因组中得到同源性最高的基因TRIAE_CS42_4DS_TGACv1_362760_AA1181940(Ensembl Plants),命名为TaHK1。生物信息学分析表明,TaHK1位于小麦4D染色体上,编码的蛋白由996个氨基酸组成,分子质量为109. 70 ku,等电点为5. 71; TaHK1蛋白二级结构由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角4种构象组成;亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞膜的可能性较大,跨膜结构域预测其具有2个跨膜域;蛋白保守结构域分析发现,TaHK1具有典型的细胞分裂素受体的完整结构域,并且含有87个磷酸化位点。表达谱分析显示,TaHK1在根、茎、叶、雄蕊和小穗等各个组织有广泛表达;此外,TaHK1表达量受低磷胁迫和多种病原菌侵染诱导,而受干旱胁迫抑制,推测其在小麦生长发育、抵御干旱胁迫和病原菌侵染过程中可能发挥重要作用。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

携带乙肝大包膜蛋白L基因与结核Esat6融合基因植物表达载体的构建及鉴定

构建包含编码结核杆菌Esat6基因和乙肝病毒大包膜蛋白(L蛋白)基因的植物双元表达载体,并转化根癌农杆菌LBA4404.分别以质粒pPIC9K-L和结核杆菌基因组为模板进行PCR扩增,获得L和Esat6基因,然后运用部分重叠聚合酶链式反应扩增出L-Esat6融合基因片段,连接到有玉米特异性启动子globulin-1的p...     

银杏过氧化物酶基因POD1的克隆及表达分析

利用RACE技术从银杏中克隆到过氧化物酶基因(GbPOD1,FJ599670)的cDNA全长。GbPOD1基因编码序列为1 092 bp,编码一条长为329Aa的成熟阴离子POD蛋白,预测成熟蛋白分子量为35.8 kDa,等电点为8.10。Southern杂交及进化树分析结果表明,GbPOD1和其他物种的POD源自于相同的祖先,属于植物类型III的POD同工酶编码基因,为多基因家族。RT-PCR分析表明,GbPOD1在银杏的根、茎、叶和果中都有表达,在茎中的相对表达量最高,其次为根和果,而叶部位表达水平最低。植物激素MeJA、金属离子Cu和Cd以及MV和WOU的处理能显著诱导GbPOD1基因的表达。研究结果显示,在银杏叶片中,GbPOD1属于多功能基因,具有潜在的参与重金属污染清除及伤害处理防御方面的功能。     

NPR1和Cry1Ab13-1基因双价植物表达载体的构建及在玉米中的转化

单一的抗病、抗虫品种已经不能满足需求,因此,本研究通过基因工程技术构建同时具有抗病基因 NPR1 基因和抗虫基因 Cry1Ab13-1 基因并以 bar 基因为筛选标记的植物双价表达载体并进行遗传转化,以获得优良的特点同时兼具抗病抗虫的新株系。通过农杆菌介导法、花粉管通道法和超声波介导法将构建好的植物表达载体在玉米中进行遗传转化,并对 T₂代转基因植株进行 PCR 检测、Southernblotting 整合度检测、实时荧光定量 PCR 转录水平检测、室外抗虫以及室内抗病初步鉴定。结果表明：共获得 T₂代 PCR 阳性植株 14 株。Southern Blot 结果表明,NPR1 和 Cry1Ab13-1 双价基因已经分别以单拷贝形式整合到玉米受体中。实时荧光定量 PCR 结果表明 NPR1 和 Cry1Ab13-1 双价基因在不同组织间相对表达量均高于阴性对照,NPR1 基因在根、茎、叶中相对表达量均值分别为 3.302、1.45、9.75;Cry1Ab13-1 基因在根、茎、叶中相对表达量均值分别为 3.15、1.61、9.89。室外接虫...     

梭梭HaNAC1基因的亚细胞定位、转录激活及表达分析

HaNAC1为本课题组前期从梭梭幼苗中克隆得到的一个NAC家族(ATAF亚家族)转录因子编码基因,本研究将对该基因进行进一步的活性验证和功能分析。通过烟草叶片细胞中的绿色荧光蛋白瞬时表达系统对表达蛋白进行亚细胞定位,结果表明HaNAC1蛋白位于细胞核中。构建AH109酵母pGBKT7-HaNAC1表达载体,证明该转录因子在酵母中具有转录激活活性。利用实时荧光定量PCR方法测定HaNAC1在盐、旱胁迫条件下的表达水平,结果显示该基因的表达量与盐胁迫的浓度呈现正相关,表明HaNAC1参与调节梭梭的盐胁迫响应。本研究探索了HaNAC1的定位和表达,为梭梭抗逆体系的功能基因挖掘及胁迫应答机理提供科学依据。     

大豆耐铝毒候选基因GmSTOP1的克隆与表达分析

酸性土壤中的铝毒害是限制作物生长和产量的主要因素之一。拟南芥中的At STOP1(Arabidopsis thaliana sensitive to proton rhizotoxicity 1)是一个调控多种铝毒耐受机制相关基因表达的转录因子,在拟南芥耐铝毒中发挥重要作用。为研究大豆中STOP1-like基因的表达特性,本研究利用RT-PCR从耐铝毒大豆品种科丰1号中克隆了一个位于第16染色体的STOP1-like基因,命名为Gm STOP1。该基因的编码区(coding DNA sequence,CDS)序列长度为1566 bp,编码521个氨基酸。在Gm STOP1起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到多种顺式作用元件,包括与激素、热、逆境响应等相关的应答元件,如ABRE、HSE、TC-rich重复序列等。蛋白质结构预测表明Gm STOP1不具有跨膜结构和信号肽,含有4个保守的Cys-2-His-2锌指蛋白结构域。系统进化分析显示Gm STOP1与菜豆(Phaseolus vulgaris)中的STOP1-like蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示Gm STOP1定位于细胞核,说明Gm STOP1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。Gm STOP1基因在种子中的相对表达量最高,在根、茎尖分生组织、茎、叶、花、荚等多种组织中也均有表达。用25μmol L–1 Al Cl3溶液处理大豆幼苗,Gm STOP1基因在根中上调表达,24 h达到最高相对表达量,约为对照(0μmol L–1 Al Cl3)的9.2倍,表明该基因的表达受铝离子的诱导。此外,ABA、Na Cl和PEG等胁迫也能诱导大豆根和叶中Gm STOP1基因的上调表达。由此推测Gm STOP1基因可能参与大豆对铝毒、高盐和渗透等非生物胁迫的应答过程。     

棉花C2H2类型锌指蛋白基因GhSIZ1的克隆及表达分析

通过RT-PCR技术从陆地棉中克隆到1个编码C2H2型锌指蛋白的基因,命名为Gh SIZ1(Stress Induced Zinc finger protein1)。该基因编码239个氨基酸残基,预测蛋白分子量为26.6205 k D,等电点为6.52。Gh SIZ1包含一个C2H2型锌指结构域,在其N端含有保守的L-box,C–末端含有一个转录抑制结构域EAR/DLN-box。系统发育树分析表明Gh SIZ1与可可(XP_007044496.1)和中粒咖啡(CDP00218.1)中的锌指蛋白亲缘关系较近。实时定量PCR分析Gh SIZ1在棉花各组织中均有表达,但在根中表达量最高。低温、高盐、干旱胁迫处理后Gh SIZ1的表达水平显著上调。亚细胞定位分析表明,Gh SIZ1定位在细胞核中。本研究表明,Gh SIZ1可能在棉花响应低温、高盐、干旱等非生物胁迫中起着重要作用。     

油菜育性相关多聚半乳糖醛酸酶基因MF6的获得及表达分析

本研究目的在于利用化学杀雄剂"化杀灵WP1"诱导甘蓝型油菜R121产生雄性不育,并对花蕾中的差异表达基因进行分离、筛选及定量表达分析。首先,通过抑制消减杂交技术(SSH)和反向Northern斑点杂交技术,分离和筛选出在雄性不育花蕾中差异表达的基因片段。然后,将差异片段测序后在NCBI数据库中进行同源性比对及功能分析。最后,对差异表达基因进行反转录荧光定量表达(RT-QPCR)分析。本研究从筛选出来的6个阳性克隆中获得一个与多聚半乳糖醛酸酶基因(MF6)100%同源的基因片段,该基因被认为与花粉生长发育及花粉成熟密切相关。对MF6基因在不同长度及不同育性花蕾中的表达量进行了定量分析,结果显示,MF6基因在雄性可育花蕾中的表达量均高于雄性不育花蕾,且在蕾长1.00mm～1.50mm和3.50mm～4.00mm时分别达到了18.53倍和43.15倍的差异。因此,我们推测"化杀灵WP1"主要通过抑制花粉母细胞减数分裂时期中MF6基因的表达,使花粉产生败育;同时,MF6基因的表达可能也与花丝的伸长生长有关。     

玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b基因的克隆、表达及亚细胞定位分析

拟南芥TOC1基因在拟南芥中与2个MYB类蛋白基因LHY (Late elongated hypocotyl)、CCA1(Circadian clock associated1)组成中央振荡器,通过光周期调节途径调控拟南芥对光照的响应。为了揭示玉米中央振荡器中重要基因ZmTOC1a与ZmTOC1b的生物学功能,通过同源搜索找到玉米中的2个同源基因ZmTOC1a与ZmTOC1b,并通过同源克隆得到了这2个基因的序列,进而对这2个基因进行组织表达分析和编码蛋白的亚细胞定位。结果表明,通过同源克隆得到ZmTOC1a的开放阅读框的总长度为1 236 bp,共编码411个氨基酸; ZmTOC1b的开放阅读框的全长为1 554 bp,共编码517个氨基酸。通过Prot PARAM进行基因编码蛋白质的理化性质分析,ZmTOC1a与ZmTOC1b均为酸性蛋白。Net Phos 3. 1 Server预测结果显示,ZmTOC1a存在46个潜在磷酸化位点,其中丝氨酸36个,苏氨酸8个,酪氨酸2个; ZmTOC1b共存在53个潜在磷酸化位点,丝氨酸38个,苏氨酸12个,酪氨酸3个。在玉米中选取11个不同的组织进行qRT-PCR分析,结果表明,ZmTOC1a及ZmTOC1b分别在胚根以及胚芽鞘中高表达。通过构建目的蛋白与GFP融合的表达载体并注射烟草,发现ZmTOC1a及ZmTOC1b表达蛋白主要集中在细胞核中。综上所述,玉米TOC1基因可能与拟南芥TOC1基因作用一致,在玉米的生物钟调节中起到了重要的作用。