猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据已经发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(App)dsbE-like基因的序列,设计了一对可扩增374bp目的片段的特异性引物。经PCR扩增,App1-4和6-10型标准菌株均能扩出约374bp的片段,而对大肠埃希菌(K88)、巴氏杆菌(5:A)和链球菌(Ⅱ)的扩增结果均为阴性。用建立的方法来检测分离菌株MC、ME和MH,结果表明,该方法能用于临床分离株的检测。灵敏性试验表明本方法对App菌液最低检出浓度为71cfu/mL。建立的PCR检测App的方法可用于临床上对App的检测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)外膜脂蛋白基因序列，设计合成了1对特异性引物。经PCR扩增，APP1～10标准血清型菌株均能扩增出大小为980bp的DNA片段，而大肠埃希氏茵、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APP DNA的敏感性可达2pg。表明，此PCR方法特异性好，敏感性高，可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及临床应用

为建立直接检测可疑病料中胸膜肺炎放线杆菌（APP）的PCR诊断方法，对用以扩增apxⅣA毒力基因3’端长约442bp的核苷酸片段的引物、模板、Taq DNA聚合酶、dNTPs的最适剂量及退火温度进行了优化筛选，并进行了特异性及重复性试验；以筛选出的优化条件，对临床可疑病料进行了PCR检测。结果，在25μL体系中，以5pmol／μL引物、0．25μL Taq DNA聚合酶、2mmol／L dNTPs、56℃退火温度对APP标准菌株apxⅣA毒力基因的扩增效果最好，重复性和稳定性高；而对类症菌株的扩增结果则为阴性，表明其特异性强。对分离到APP的病料PCR阳性率为100％（5／5）；未分离到APP的纤维渗出性病料中，新鲜与陈旧病料PCR阳性率分别为70．59％（12／17）、50．00％（4／8），而非纤维渗出性病料的PCR结果均为阴性（0／45、0／9）。结果表明，建立的PCR方法特异、快速、稳定、敏感，优于细菌学方法，它可作为APP可疑病料的理想诊断方法。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度接触性呼吸道传染病,该病可给养猪业造成巨大的经济损失。为有效控制和确诊该病,根据报道的猪胸膜肺炎放线杆菌APXIV毒株的基因序列,合成了2对可扩增长度分别为442 bp和378 bp的特异引物,建立检测胸膜肺炎放线杆菌的巢式PCR方法。利用合成的引物在扩增猪肺疫巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌和大肠杆菌等细菌DNA时,结果均为阴性。用引物检测猪胸膜肺炎放线杆菌的标准菌株可扩增出442 bp和378 bp的特异性条带。表明运用PCR法检测猪胸膜肺炎放线杆菌的特异性和灵敏性均较高,可作为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断和流行病学调查的手段。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计1对引物，扩增特异的650bp棱酸片段，建立了应用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明，12个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp特异性的核酸片段，而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，PCR的最低检出限量为500个放线杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省不同地区分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌菌株进行检测．结果14株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明，病变部位不同，胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同，其中以扁桃体的检出率最高。     

胸膜肺炎放线杆菌的实时荧光PCR检测

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的危害养猪业的五大疾病之一。至目前为止App共报道有2个生物型15个血清型。所有型都可能致病，但有显著差异。使用血清学方法监测猪传染性胸膜肺炎有其局限。一些猪细菌分离培养阳性，但血清反应仍为阴性，对这些猪群只能使用病原分离进行确诊。亚临床感染及处于潜伏期的动物，     

猪传染性胸膜肺炎PCR诊断方法的建立

根据已发表的猪胸膜肺炎放线杆菌APXIV毒素的基因序列，自行设计和合成了二对可扩增448bp和365bp目的片段的引物，成功的建立了检测APP的套式PCR方法。通过对猪肺疫巴氏杆菌、猪链球菌、大肠杆菌、猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体和猪丹毒杆菌的DNA进行了PCR检测，结果均为阴性；对猪胸膜肺炎放线杆菌的1、2、5、6、7、9国际标准血清型均扩增出448bp和365bp的特异性条带；检测的敏感度一步PCR可达到5OO个细菌，最低检出DNA浓度可达到0．585ng／mL；套式PCR可达到50个细菌，最低检出DNA浓度可达到58．5pg／mL。另外，对5株从病猪体内分离的猪胸膜肺炎放线杆菌进行了检测，5株均成阳性反应；对10只屠宰猪的肺脏分离物进行了检测，结果1份为阳性。结果表明此法特异性和敏感性均很高，可做为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断和流行病学调查的手段。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的套式PCR检测

根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)apxⅣA毒素基因的序列,设计了两对特异性引物P1/P4和P6/P8,建立了检测APP全部15个血清型的套式PCR方法.对APP的15个国际标准血清型和国内的APP菌株进行了PCR检测,都能得到223 bp的特异性扩增产物;检测的灵敏度可达1.3 CFU,最低检出DNA浓度为9 fg.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌OmLA-PCR检测方法的建立

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumo niae,APP）旧称胸膜肺炎嗜血杆菌（Haemophilus pleuropneunmniae,HP）,是一种能引起猪出血性、化脓性、纤维素性胸膜肺炎的高度传染性、致死性病原菌,能引起各个年龄阶段的猪发生急性或慢性感染。目前,人们采取了很多措施和方法来控制和预防该病,但结果都不太理想。对该病的诊断主要有病原学方法、血清学方法和分子生物学方法。病原学方法费时费力。由于胸膜肺炎放线杆菌有多个血清型,各血清型之间没有很好的交叉反应,且有些呈隐性感染,因此影响了血清学方法的准确性。目前,分子生物学方法已广泛用于病原的诊断,为快速诊断疫病奠定了基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据GenBank登录的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1~14型的表面抗原蛋白D15和16S rRNA基因序列,设计2对特异性引物,分别扩增出637、431 bp两条核苷酸片段,建立了APP的多重PCR检测方法。特异性结果表明,血清1、3、5a、8、10型能扩增出两条与预期大小的片段,而扩增的大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌均成阴性。敏感性试验结果表明,最低检出浓度为50/μL。对临床分离的5株疑似APP菌株进行PCR,结果表明,其中4株为阳性,1株为阴性。提示,该方法的特异性和敏感性均良好。     

猪的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

在已经建立猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的优化,成功地建立了APP、PM、HPS的复合PCR实验室诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增出APP的342bp、PM的457bp和HPS的821bp的特异性片段。该复合PCR能同时检测到100个每种细菌或50pg的APP或HPS的DNA和500pg的PM的DNA。该三重复合PCR的敏感性同已报道的单PCR一致。该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

在已建立的副猪嗜血杆菌(HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)的单重PCR检测方法的基础上,通过对扩增条件的优化,利用一次PCR反应可同时扩增出APP的256 bp、Pm的457 bp、HPS的822 bp的特异性片段,建立了HPS、Pm、APP的多重PCR实验室诊断方法。该复合PCR可检测60 pg的HPS、120 pg的Pm、50 pg的APP。利用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性猪体内分离到的39株细菌,结果显示HPS、Pm、APP分别为12、16、2株,对39份病料的检测与常规细菌分离鉴定结果一致,可见该方法适用于HPS、APP、Pm的临床快速检测。     

套式PCR和实时荧光PCR在检测胸膜肺炎放线杆菌上的应用

应用胸膜肺炎放线杆菌套式PCR和实时荧光PCR检测方法分别检测了不同来源的猪鼻拭子、肺、扁桃体等494份样品。套式PCR 77份阳性,实时荧光PCR 62份阳性,前者的阳性完全覆盖了后者的阳性,两者符合率为97%(479/494)。2种方法均可应用于猪传染性胸膜肺炎的诊断和监测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

在已经建立的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的筛选,成功地建立了APP、PM、HPS复合PCR诊断方法,并应用于临床。利用一次PCR反应,即可同时扩增APP的342bp、PM的457bp和HPS的821bp的特异性片段。该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

血清3型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定

2005年3月,广东省惠州市某猪场发生了一起疑似猪传染性胸膜肺炎放线杆菌引起猪只死亡的病例,经细菌分离培养、生化鉴定、PCR、血清学鉴定,确诊该病原为血清3型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。     

胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及临床应用

为建立检测可疑病料中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,针对App的RTX毒素(ApxⅣA毒素)毒力基因长约449 bp的片段设计引物,以App 10个血清型的基因组分别作为模板,对PCR扩增条件进行优化筛选,并进行了特异性及重复性试验。对副猪嗜血杆菌、马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌的扩增结果为阴性,表明该PCR方法特异性强,建立了该菌的种属特异性PCR方法。以筛选出的优化条件,对22份临床可疑病料进行了检测。结果表明,建立的PCR方法特异、快速、稳定、敏感,优于传统的细菌学方法,可作为App可疑病料的检测方法。