铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族鉴定及生物信息学分析

[目的]鉴定铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族成员,并进行生物信息学分析,为深入研究该家族在铁皮石斛热应激响应中的调控机制提供理论参考.[方法]以拟南芥和水稻Hsf蛋白氨基酸序列为参考序列,在铁皮石斛蛋白数据中搜索其同源蛋白序列,利用SMART和Pfam数据库鉴定出其Hsf基因家族成员.利用生物信息学方法对铁皮石斛Hsf基因家族组成、基因结构、启动子区顺式作用元件及其编码蛋白结构域和进化关系等进行分析.[结果]共鉴定获得23个铁皮石斛Hsf基因家族成员,编码氨基酸数量为132~514个,平均343个,多数属于酸性蛋白和亲水性蛋白,可分为HsfA、HsfB和HsfC组,其中HsfA组成员13个、HsfB组成员9个、HsfC组成员1个.除DoHsfA3仅包含motif 1和motif 2外,其他HsfA组蛋白均含有motif 1~motif 5,HsfB和HsfC组蛋白均缺少motif 5.铁皮石斛Hsf蛋白缺少A9、B3、B5和C1亚类成员,与同属于单子叶兰科植物的小兰屿蝴蝶兰Hsf蛋白亲缘关系最近.HsfA组成员包含完整的HSF功能域和卷曲螺旋(CC)功能域,HsfB和HsfC组成员缺少或含不完整的CC功能域.DoHsfA1A蛋白具有保守的丝氨酸—苯丙氨酸—缬氨酸—精氨酸—谷氨酰胺序列.铁皮石斛Hsf基因启动子区含有大量激素响应、胁迫响应和生长相关元件.[结论]铁皮石斛Hsf基因家族成员进化较保守,其生物学功能存在明显物种特异性,进化关系较复杂,推测其在不同的非生物胁迫和植物激素信号途径中发挥潜在"节点"作用.     

棉花中一个新的类DREB转录因子(GhDREB2B)的克隆、序列特征及表达分析

棉花是盐碱地改良的重要作物。文章利用盐胁迫处理棉花耐盐品种‘中棉所49’,筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合与分析,利用RT-PCR的方法,克隆了一个新的棉花类DREB转录因子,命名为GhDREB2B(GenBank登录号为GQ848094)。该基因编码351个氨基酸残基,分子量约39 kD,推导的氨基酸序列与杨树、番茄、大豆、拟南芥等物种中的DREB基因家族成员之间存在一定程度的同源性,均含AP2/ERF保守结构域,推测该基因在棉花中是一个新的DREB类转录因子。利用荧光定量RT-PCR对该转录因子表达特征的分析表明：GhDREB2B在棉花苗期经盐胁迫诱导后表达量迅速升高,在0.7%的NaCl胁迫诱导下,表达量达到最高值,但该转录因子并不受ABA的诱导。推测GhDREB2B在棉花受到干旱和盐胁迫条件下发挥重要功能。     

百合热激转录因子基因LlHsfC1的鉴定、表达与亚细胞定位

为了深入研究百合热激反应的分子机制,以麝香百合杂种系品种‘白天堂’为试验材料,鉴定了百合C类Hsf基因LlHsfC1,其开放阅读框为780 bp,编码259个氨基酸,推定蛋白质分子质量为30.1 ku,理论等电点为9.61.LlHsfC1蛋白含有热激转录因子的特征结构域,但与百合A类Hsf相比,LlHsfC1缺少转录激活模序和核输出信号.亚细胞定位分析表明LlHsfC1在细胞核中表达.37℃胁迫处理显著促进了LlHsfC1的表达;LlHsfC1的表达受热胁迫与Ca~(2+)处理协同诱导.此外,构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-LlHsfC1,为进一步研究LlHsfC1基因的功能提供了基础.     

芥菜全基因组中Hsf基因家族鉴定与分析

【目的】通过鉴定与分析芥菜基因组中Hsf转录因子家族成员,为芥菜Hsf基因功能研究与遗传改良提高抗逆性提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法分析芥菜Hsf热激转录因子家族成员的功能结构、保守基序、启动子顺式作用元件、系统进化、共线性及采用RNA-seq验证Hsf低温胁迫的基因表达。【结果】芥菜基因组中鉴定出71个Hsf基因家族成员,分布于18条染色体上,归类为3个亚家族,蛋白均含有DBD和HR-A/B结构域。BjuHsf启动子区域包含与逆境胁迫、激素、生长发育等相关顺式作用元件。系统进化与共线性分析表明,芥菜Hsf家族成员与大白菜Hsf家族成员具有更近的亲缘关系。在低温胁迫下,BjuHsf基因表达分析表明8个BjuHsf基因显著上调表达。【结论】这些显著差异表达BjuHsf基因与芥菜抗寒性极其相关,可作为芥菜耐寒性遗传改良的候选基因。     

棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表达及烟草的遗传转化

以棉花纤维组织为材料,根据NCBI棉花EST进行同源搜索、比对和序列拼接,经RT-PCR从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因(Gh GGPase2)的c DNA开放阅读框为1 335 bp,为包含445个氨基酸的蛋白质,分子质量约为49 ku。利用软件进行蛋白质序列分析,Gh GGPase2蛋白具有组氨酸三聚体(HIT)蛋白超家族的主要特性的结构域。进化树分析的结果表明棉花Gh GGPase2与猕猴桃Ad GGPase在进化上亲缘关系上较近。构建原核表达载体p ET28a-Gh GGPase2并转化大肠杆菌,将重组载体p ET28a-Gh GGPase2导入大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG诱导表达后经过SDS-PAGE分析,显示成功获得分子质量为49 ku左右的诱导表达蛋白Gh GGPase2。将Gh GGPase2基因构建到植物真核表达载体p CAMBIA2300中,利用农杆菌通过叶盘法转化烟草,经PCR分子鉴定,获得了含Gh GGPase2转基因烟草植株。研究结果将为进一步阐明该基因的生物学功能奠定基础。     

棉花GhFAD2-1基因5’UTR内含子的克隆与序列分析

【目的】对棉花~(Δ12)-油酸去饱和酶基因Gh FAD2-1 5'UTR区的内含子进行克隆和序列分析,为研究Gh FAD2-1的表达调控奠定基础。【方法】利用5'RACE技术,克隆Gh FAD2-1的5'UTR序列,结合棉花基因组序列,克隆Gh FAD2-1 5'UTR内含子,并利用PLACE等生物信息学软件对其顺式作用原件进行分析。【结果】棉花A、D基因组的Gh FAD2-1 5'UTR中各含一内含子序列,全长分别为1 103 bp、1 111 bp;Gh FAD2-1成熟mRNA的5'UTR为77bp,转录的起点碱基为T;5'UTR内含子两个剪切位点分别AA-GG、CA-GC。该内含子包括一些典型的与光响应相关的作用元件,以及与激素和胁迫因素相关的应答元件等。【结论】克隆获得了棉花A、D基因组的Gh FAD2-1基因5'UTR内含子序列;明确其转录的起点碱基及5'UTR内含子的剪切位点,为进一步在分子水平上研究Gh FAD2-1功能及其表达调控规律,为植物的遗传改良奠定了基础。     

花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因的克隆及表达分析

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和热激转录因子(heat shock factors,HSFs)在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的c DNA片段,通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列,根据序列信息设计引物,以花生叶片c DNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析。结果显示,Ah HSP70基因的ORF全长为1 962 bp,编码653个氨基酸,分子质量为71.45 k D,理论等电点p I为4.93;Ah HSF基因的ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子质量为46.03 k D,理论等电点p I为4.85。Ah HSP70与Ah HSF均不具有信号肽,为可溶性蛋白,二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对,并构建进化树进行亲缘关系分析,结果表明,Ah HSP70与大豆Gm HSP70亲缘关系较近,与番茄Sl HSP70亲缘关系比较远;Ah HSF与菜豆Pa HSF亲缘关系较近,而与蒺藜苜蓿Mt HSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对Ah HSP70和Ah HSF在热胁迫情况下的表达进行分析,结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高,Ah HSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高,热处理24 h和48 h后,表达量为对照的50倍和135倍;转录因子Ah HSF在高温胁迫3 h后表达明显升高,高温处理6 h后达到最高,随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。     

水稻HSF基因OsHsf-like的生物信息学和转录表达分析

植物热激转录因子主要调控植物热激蛋白基因的转录表达,对植物的耐热性起着重要的作用.我们利用生物信息学技术鉴定出1个新的水稻HSF基因OsHsf-like,该基因编码1条719个氨基酸的预测肽链,肽链中包含1个HSF DNA结合域和1个由2个疏水的七肽重复序列(HR-A/B)构成的寡聚域.OsHsf-like的DNA结合域具有典型的HSF DNA结合域的次级结构和三级结构.对寡聚域的结构分析和系统进化分析将OsHsf-like归于B类HSFs.OsHsf-like在水稻穗部低水平转录表达.表达水平不受热激影响.     

棉花亲环素基因GhCYP2的克隆及实时定量表达分析

[目的]分离棉花中的亲环素基因.亲环素基因是一类多基因蛋白质家族,广泛存在于高等植物各个组织和器官中,参与多种重要的生理生化过程.[方法]以小麦亲环素wCyP3基因蛋白序列(AF262984)为探针序列,在GenBank中与棉花EST序列进行tBLASTn比对,将同源性高的EST序列拼接后获得一条长912 bp的cDNA序列.[结果]序列分析表明,该cDNA含有一个编码174个氨基酸的开放阅读框,基因的编码产物为亲环素蛋白,将该基因命名为GhCYP2(GenBank登录号:JN032296).采用Clustal X将ChCYP2的氨基酸序列与其他生物亲环素氨基酸序列进行相似性比对,发现与水稻、拟南芥等生物的相似性较高,达到80;以上.利用实时荧光定量PCR技术分析了GhCYP2在棉花各个组织器官中的表达模式,检测结果显示:GhCYP2在棉花叶及18DPA棉纤维中的表达量最高,在根、茎、花、3～15DPA、21～30DPA棉纤维中均有适量表达.[结论]推测GhCYP2可能在棉花纤维伸长至次生壁合成的重叠期发挥着信号传导作用.