中国荷斯坦牛胚胎冷冻与移植受胎技术研究

牛冷冻胚胎解冻成活率达８４．４％（３８／４５）;冷冻胚胎移植总受胎率达到４６．７％（５７／１２２）,其中１９９６年达到５５．６％（２０／３６）,Ａ级胚胎达到７７．８％（２１／２７）。并在我国首次获得中国荷斯坦牛冷冻胚胎二分胚的同卵孪生牛犊,且达到４２．９％（３／７）的移植受胎率。     

牛胚胎冷冻与移植受胎技术研究

本文进行了牛胚胎冷冻与移植受胎技术研究。摸索出了提高牛冷冻胚胎成活率和移植受胎率的综合配套技术。牛冷冻胚胎解冻成活率达８４．４％（５７／１２２）。其中１９９６年移植受胎率达到５５．６％（２０／３６）。Ａ级胚胎达以７７．８％（２１／２７），并在我国首次获得中国荷斯坦牛冷冻胚胎的二分胚的同孵孪生牛犊。且达到４２．９％（３／７）移植受胎率。     

牛胚胎性别鉴定与取样胚胎移植应用技术的研究

本研究应用ＰＣＲ技术扩增牛ＳＲＹ序列进行奶牛胚胎性别鉴定。经１０９枚鲜、冻胚的移植，获鲜胚移值妊娠率５８．６％（３４／５８），常规冷冻胚胎移植妊娠率４４．４％（１２／２７），一步细管冷冻解冻胚胎移值妊娠率１６．７％（４／２４）。犊牛性别验证与ＳＲＹ鉴定结果均相符合。实验中对胚胎发育时期的划分，胚胎质量评定和胚龄的确定，胚龄与受体发情时间在移植中的关系，胚胎的切割取样，取样胚胎的冷冻进行了研究。     

进口奶牛冻胚一步解冻移植效果的研究

冷冻胚胎移植效果不仅能检验胚胎冷冻保存技术的可靠性,且直接影响牛胚移技术的普及应用与商业利益。与传统的胚胎冷冻一解冻处理技术相比较,牛冷冻胚胎解冻后立即移植给受体牛更适于现场操作,简化了移植前胚胎的分步脱甘油处理,具有省时、不需专门仪器设备等优越性。如果直接移植效果接近或超过冷冻精液人工授精技术水平（情期受胎率平均55％）,则对提高冷冻胚胎的利用率,增进国际问的引种,以及形成胚胎产业化、推动胚胎移植技术商业化具有重要意义。     

绵羊冷冻胚胎移植试验

绵羊冷冻胚胎有枚浆冻前Ａ级胚胎解冻后,胚胎等级有所下降,可用胚率为７７．９％,Ａ、Ｂ级胚移植妊娠率分别为３３．３％（１８／５４）和１６．７％（１／６）,差异不显著（Ｐ〉０．０５）;桑椹胚、早期囊胚、中期囊胚、扩张囊胚移植妊娠率分别为２０．８％（５／２５）、４２．９％（６／１４）、３５．７％（５／１４）５ ３７．５％（３／８）,囊胚期胚胎移植妊娠率较高,但差异不显著（Ｐ〉０．０５）     

本地黄牛冷冻胚胎移植技术及其受胎率影响因素分析

笔者选用97头山东省平度市当地黄牛作为受体，采用玻璃化解冻进行加拿大进口北美性控高产荷斯坦奶牛冷冻胚胎移植。试验分别从冷冻胚胎级别、受体牛黄体直径、移植者技术水平、胚胎解冻后的停留时间，对冷冻胚胎移植受胎率进行了分析比较。结果表明：A级胚胎（46．3％）比B级胚胎（31．6％）、C级胚胎（0）受胎率高；受体牛黄体直径在1．0～1．5cm（49．1％）之间较2cm（28．1％）、2．5cm时受胎率要高；移植者技术水平的高（42．3％）低（21．1％）其受胎率相差较大；胚胎解冻后停留的时间10～20min（37．8％）、1～2h（46．9％）、4～6h（25％）对受胎率也影响较大。说明影响当地黄牛移植高产荷斯坦奶牛冷冻胚胎受胎率的因素主要有冷冻胚胎级别、受体牛黄体直径、移植者技术水平、胚胎解冻后停留的时间。     

奶牛胚胎分割与半胚裸露冷冻保存试验

本试验研究了①Ａ、Ｂ、Ｃ三个质量等级胚胎的分割效果；②五种不同冷冻方法冷冻裸露半胚的存活情况；③冻前培养３．０、１．５～２．０、１．０小时的裸露半胚存活率。结果①Ａ、Ｂ、Ｃ级胚胎的分割成功率分别为９５．８％（９２／９６）、７且．４％（７０／９８）、３０％（６／２０），三者间差异极显著（Ｐ＜０．０１）；②半胚冷冻前以２０％ＦＣＳ－ＰＢＳ液培养３．０小时后，以五种不同冷冻方法冷冻，均未获得存活半胚；③半胚冷冻前培养３．０、１．５～２．０、１．０小时后，以添加１０％而聚糖的１０％甘油＋０．１Ｍ蔗糖／ＰＢＳ液冷冻，分别获得了０％（０／４５）、６８．８％（１１／１６）、７５．０％（９／１２）的存活率。结果表明，胚胎质量是影响胚胎分割成功率的关键因素，半胚冷冻前的培养时间是影响裸露半胚存活的重要因素。     

奶牛胚胎体外保存时间和温度对移植受胎率的影响

试验对胚胎在体外保存时间的长短及温度与移植妊娠率的关系进行统计分析，胚胎收集后分别在0-3h,3-6h和6h后冷冻，解冻后移植受胎率分别为46.07%,43.33%,30.56%,0-3h和3-6h冷冻的胚胎，移植受胎率没有明显差异（P〉0。05），6h后的冻胚与6h以前的冻胚移植受胎率差异显著（P〈0．05）。胚胎分别在室温和37℃保存5h后冷冻，解冻后移植受胎率分别为39．74％、42．24％（P〉0．05）。     

牛胚胎移植技术发展概况

家畜胚胎移植是家畜胚胎工程的重要组成部分,目前已成为一项比较成熟的生物技术。我国目前在牛的超数排卵、同期发情、胚胎移植、胚胎冷冻、胚胎分割、性别鉴定等技术已与国外基本同步。在正常情况下,平均每头供体牛获可用胚5．6枚,鲜胚移植受胎率为55％～70％,冻胚移植受胎率为45％～60%．每年移植受体牛在5000头以上。     

奶牛胚胎移植实用技术的研究

笔者于１９９５￣１９９７年进行了为期３年的奶牛胚胎移植实用技术的研究。３年共移植奶牛胚胎１３７枚，受胎率为３５．７７％（４９／１３７）。移植Ａ级胚胎的受胎率为７０％（７／１０），移植Ｂ级胚胎的受胎率为４３．０２％（３７／８６），移植Ｃ级胚胎的受胎率为１２．１９％（５／４１）。移植Ａ级胚胎的受胎率比移植Ｂ级胚胎的受胎率高２６．９８％（Ｐ〉０．０５）；移植Ａ级胚胎和Ｂ级胚胎的受胎率分别比移植Ｃ级胚胎的     

胚胎因素对奶牛体外受精胚胎解冻孵化影响的试验研究

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现：在胚胎因素中，胚胎类型（冻胚和鲜胚）与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响（P〉0．05）；冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响显著（P〈0．01）；冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著（P〈0．05），解冻后A级胚胎存活率（80％，128／160）、囊胚孵化率（58．75％，94／160）显著高于B级胚胎存活率（59．38％，95／160）和囊胚孵化率（37．5％，60／160）（P〈0．05）；解冻水浴温度（20℃、30℃）对培养效果有极显著影响（P〈0．01）。     

绵羊体内冻胚与体外冻胚移植效果对比观察

在繁殖季节10月，利用萨福克、无角道塞特和边区莱斯特品种羊的体内和体外冷冻胚胎，以小尾寒羊为受体进行胚胎移植，结果如下：受体羊的同期发情率达82.3%，体内冻胚的受胎率（54.5%）和胚胎利用率（50.0%）均明显高于体外冻胚的受胎率（30.6%）和胚胎利用率（27.3%）,差异极显著（P<0.001）。     

绵羊非繁殖季节体内与体外冻胚移植效果研究

在非繁殖季节，利用萨福克、无角道塞特和边区菜斯特品种羊的体内或体外冷冻胚胎，以小尾寒羊为受体进行胚胎移植，结果如下：受体羊的同期发情率达76．1％，体内冻胚的受胎率（54．5％）和胚胎利用率（50，0％）均明显高于体外冻胚的受胎率（26．1％）和胚胎利用率（22.7％）（p＜0.001），差异极显著。     

影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素

试验对影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素进行探讨，以找出理想的玻璃化冷冻方法。在测试的５种玻璃化溶液中，含３５％乙二醇（ＥＧ）和１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的溶液（ＶＳ１）对胚胎的毒性最小。用ＶＳ１冷冻桑椹胚和囊胚的理想程序是：在室温下使胚胎分别在２０％ＥＧ和３５％ＥＧ中平衡２、３分钟后，移入ＶＳ１中，０．５分钟内（囊胚也可在２分钟后）投入液氮中冷冻。桑椹胚的存活率为９１．７％（３３／３６），囊胚的存活率为９７．１％（３３／３４）～９７．３％（３６／３７）。８～１６细胞胚胎的理想冷冻程序为：在室温下使胚胎在２０％ＥＧ、３５％ＥＧ中平衡２、３分钟，移入４℃的３７％ＥＧ＋１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中平衡２分或１０分钟后冷冻，胚胎存活率分别为１００％（３７／３７）、８６．１％（３１／３６）。     

试管水牛技术研究

水牛卵巢卵母细胞经体外成熟培养、体外受精和受精卵在体外培育的胚胎移植给受体母水牛,结果表明：①卵母细胞体外培养成熟率71．6％、受精分裂率52．8％、囊胚率(占授精卵母细胞)27．2％。②双鲜胚移植受胎率36．2％(30．0％～44．8％),双胎率24％;双冻胚移植受胎率20．0％;生产试管水牛24头,全部成活,其中冻胚试管水牛3头;双胞胎3对。③胚胎冷冻方面：采用玻璃化胚胎冷冻技术,冷冻胚胎解冻后存活率64．4%。     

奶牛胚胎冷冻保存技术研究

胚胎冷冻保存是胚胎移植过程中的一个重要技术环节,不仅保存了多余的鲜胚,更有利于随时随地地实施胚胎移植工作。本试验对超排获得的胚胎用分步法和一步法进行冷冻、贮存和移植。用分步法生产可用胚胎25枚,冻存24枚;用一步法生产可用胚胎56枚,冻存53枚。分步法的移植受胎率达到50．00％,略高于一步法的47．17％,但差异不显著（P〉0．05）。一步法在保证移植效果的前提下,具有制作简单、易于标准化生产、应用非常方便的优点。     

切割取样后胚胎的冷冻保存技术的研究

研究了切割取样后小鼠胚胎和牛胚胎冷冻-解冻的技术方法。结果表明：（1）分别以10％甘油、10％乙二醇作为冷冻液以及在以上两种冷冻液中分别添加10％葡聚糖＋0．1mol／L蔗糖作为冷冻液常规方法冷冻切割后的小鼠胚胎，冷冻-解冻后体外培养72h总发育率分别为56．9％（259／455）、81．8％（604／738）、84．8％（540／637）和59．5％（308／518）。（2）取样后胚胎体外短暂培养（0-4h）并不能提高切割取样后小鼠胚胎冷冻-解冻体外培养发育率。（3）切割取样小鼠胚胎在25％甘油＋0．25mol／L蔗糖＋20％的血清为冷冻液，在-100～-110℃左右熏蒸2min快速冷冻后体外培养发育率为73．3％（33／45），切割取样牛胚胎快速冷冻-解冻移植妊娠率为57．1％（4／7）。     

非繁殖季节胚胎因素对绵羊胚胎移植影响的研究

在非繁殖季节（6月份）利用进口绵羊胚胎，手术法移植。通过胚胎类型、冷冻胚胎解冻后停留时间以及胚胎发育阶段对绵羊胚胎移植效果的分析。得出以下结论：①鲜胚移植妊娠率和产羔率显著高于冻胚：鲜胚为61.11％（11/18）和50.00％（9/18），冻胚为48.11％（153/318）和46.86％（149/318）；②随冷冻胚胎解冻后停留时间的延长胚胎移植效果有升高的趋势；③从桑椹胚到囊胚时期胚胎发育阶段对胚胎移植效果没有明显影响。     

奶牛冷冻胚胎直接移植法的应用试验

直接移植法大大简化了冷冻胚胎的移植步骤，使胚胎移植的大规模推广应用成为可能。本试验采用１．６１Ｍ的乙二醇代替甘油作冷冻保护剂，共冷冻保存Ａ、Ｂ级奶牛胚胎２７６枚。解冻，在１０分钟内直接装枪移植给受体奶牛。其移植青年牛４２，１８０天后确认妊娠２４头，受胎率为５７．１４％；移植成母牛８５，１８０天后确认妊娠３７头，受胎率为４３．５３％。两者合计，共植受体奶牛１２７头，确认受胎６１头，受胎率为４８．０３     

牛体外受精胚胎一步脱防冻剂冷冻方法的研究

为了研究适合于牛体外受精胚胎的一步除防冻剂的冷冻方法，特进行两个试验。试验１分别用１．５Ｍ甘油＋０．２５Ｍ蔗糖、１．５Ｍ乙二醇和１．５Ｍ丙二醇作防冻剂冷冻体外受精后第７天，已发育至囊胚阶段的牛胚胎。使胚胎降温至－７℃后，植冰，然后以０．３℃／分的速率降温至－３０℃，立即将胚胎投入液氮中冷冻保存。在３７℃水中解冻胚胎后，使其直接在含１５％胎犊血清（ＦＣＳ）的磷酸缓冲液（ＰＢＳ）中脱去防冻剂。经体外培养７２ｈ后，３组胚胎的孵化率分别为７７．２７％（１０２／１３２）、７３．２４％（１０４／１４２）、４７．９０％（５７／１１９），第１、２组的孵化率极显著高于第３组（Ｐ＜０．０１），说明用１．５Ｍ丙二醇溶液冷冻的胚胎，在解冻后不宜直接在ＰＢＳ中脱防冻剂。试验２比较用不同浓度（１．０Ｍ０１．５Ｍ，２．０Ｍ）的乙二醇和不同投液氮温度（－２５℃，－３０℃，－３５℃）冷冻胚胎的效果。结果表明乙二醇浓度和投液氮温度对胚胎孵化率均无显著影响（Ｐ＞０．０５），各组胚胎的孵化率变动于７４．４４％－８５．４８％之间。