2株鸭瘟病毒强毒株的分离鉴定

通过鸭胚接种,从山东和安徽两地疑似鸭瘟临床病例中分离鸭瘟病毒,分别命名为SD株和AH株。根据鸭瘟病毒疫苗株UL26-UL30的基因序列,设计引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增UL27(gB)的全基因,并对扩增的片段进行测序。结果表明,扩增片段包括完整的gB基因,长度均为3 003 bp,2株鸭瘟病毒分离株与鸭瘟病毒疫苗株的gB基因同源性均为99.8%,并且分别发生4个和2个氨基酸的变异。2分离株无血凝特性,鸭胚半数致死量DELD50分别为10-4.5/0.2 mL和10-4.35/0.2 mL,动物回归试验可致15日龄雏鸭死亡,鉴定为鸭瘟病毒强毒株。     

鸭瘟强毒川W株的分离、鉴定及毒力测定

从四川成都某鸭场分离得到一株疑似鸭瘟病毒，经细胞培养、中和实验、PCR鉴定。证明分离株为鸭瘟病毒，毒力测定及动物实验表明其可能为强毒株。试验结果提示鸭瘟病毒毒力变异和增强都会使弱毒疫苗的免疫保护作用下降。     

四川省鸭瘟病原的分离鉴定

用9～10日龄鸭胚和血清交叉中和试验从四川省七个疑似鸭瘟发病片区分离鉴定了七株鸭瘟病毒。经测定,这七个毒株与鸭瘟标准强毒AV1221F16代的血清型、抗原性一致,没有血凝特性,对氯仿敏感,属于DNA病毒;鸭胚半数致死量DELD50为10^-4.59～10^-5.92/0.2mL;本动物回归使四川麻鸭在3～7天死亡;电镜下观察成熟病毒粒子呈球形成近似球形,带有囊膜,直径150～160nm,具有疱疹病毒的典型形态结构。     

鸭瘟病毒地方株（JLSY株）的分离与鉴定

鸭瘟传播速度快,死亡率高,对养鸭业危害极大。为了对吉林省德惠市一例疑似鸭瘟的送检病例进行确诊,将病料进行了病毒分离培养、电镜观察、中和试验、动物回归试验和PCR检测。结果分离出1株病毒（JLSY）,经动物回归试验,接种JLSY毒株能使14日龄雏鸭于接种一周后全部发病,再经一周全部死亡,出现与自然感染病例相同的症状、病变。经PCR扩增肝脏病料,分离毒株尿囊液、标准毒株尿囊液均出现1条约376bp的特异性条带,与引物设计时预期的目的片段大小相吻合。结果表明所分离毒株为鸭瘟病毒。     

鸭瘟病毒基因组核酸的制备

用鸭瘟病毒国内标准株DPV34F2接种10—l2日龄的非免疫鸭胚，37℃培养5d后，收获清亮尿囊液，采用高速离心结合切向超滤的方法浓缩纯化含毒尿囊液。然后通过改进的酚：氯仿抽提法提取其中的病毒基因组核酸，用4对特异引物对抽提物进行PCR鉴定。结果表明，应用上述方法可以获得较完整的鸭瘟病毒基因组核酸。     

PCR用于鸭瘟病毒诊断的研究

根据鸭瘟病毒UL6和UL7基因序列,设计合成了一对引物,以2株疫苗株、1株强毒株和1株山东分离株DNA为模板,进行PCR扩增,得到预期690bp的目的片段.将扩增的目的片段克隆到pMD18-T载体,经Amp平板筛选,HindⅢ、BamHⅠ双酶切鉴定,获得阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,与参考序列比较,山东分离株与参考序列的同源性为99.7%,其余3株DPV与参考序列的同源性均为100%.应用PCR可检测人工感染和自然感染鸭瘟的组织中的鸭瘟病毒,表明PCR检测鸭瘟病毒具有很高的特异性、敏感性,该法能够用于鸭瘟急性及亚临床感染的检测与诊断.     

鸭瘟病毒分子生物学探讨

鸭瘟病毒属疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科,病毒粒子呈球形,有囊膜的线状双股DNA,与蛋白缠绕形成病毒核心,大小约为150 kb,两端为末端重复序列,中间有内部重复序列.衣壳为对称的二十面体,外观呈六角形,它由162个相互连接呈放射状排列且有中空轴孔的壳粒组成.核衣壳外为外膜,其绕以囊膜形成成熟的病毒粒子.囊膜蛋白为病毒的主要保护性抗原,介导病毒进入细胞,促进病毒的成熟与释放.文中对病毒形态结构、蛋白特性等方面进行论述,以期为更清楚地认识该病毒的特性提供参考资料.     

用反向被动血凝试验检测鸭瘟病毒

鸭瘟病毒(DPV)引起一种鸭的急性、致死性、接触性疫病,对全世界产鸭地区具有经济上的重要性。诊断急性 DPV 感染的方法通常是观察特征性的组织损伤和分离DPV。分离毒力较弱的毒系的方法是接种乳鸭。作病毒的体外检测一直很困难,因为有的毒系的 DPV 在细胞培养物中不产生蚀斑。已用 IF 法作诊断,但有时对荧光的判读较困难。Rycaj 首先报道了 RPHA 试验。在该试验中,抗体致敏红细胞在相应抗原存在时发生凝集。这一方法已用于检测和鉴定其它病毒。本研究旨在确定可否将 RPHA 发展成作 DPV 检测的方法。     

鸭瘟病毒北京株UL6和UL7基因的克隆及序列测定

依据文献报道的鸭瘟病毒（DPV）的核苷酸序列，设计和合成了二对引物，分别为SP1和SP2，LP1和LP2。北京株鸭瘟病毒于鸭胚中增殖，差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化，按酚－氯仿法抽提DNA。然后以DPV DNA为模板进行PCR，分别扩散增出与理论相符的421bp和1209bp的二个DNA片段，并将它们克隆于质粒pGEM-T Easy中。经酶切和质粒PCR，筛选含有目的基因的重组质粒。重组质粒以步移法从双方向测序，获1586bp的核苷酸序列。研究发现这1586bp的核苷酸序列与文献报道的UL6和UL7基因序列的同源性为99％，仅有一个碱基的差异。进一步作氨基酸分析，发现这个碱基所引起的变异为无意义突变（CCT→CCC）。结果表明，鸭瘟病毒的UL6和UL7基因在不同的毒株中高度保守。     

鸭瘟病毒间接ELISA方法的建立

通过SPF鸡胚进行鸭瘟病毒培养和增殖,采用反复冻融后离心-0.22μm滤膜过滤-差速离心-蔗糖密度梯度离心法(sucrose-density-gradient-centrifugation,SDGC),纯化后病毒粒子作为ELISA包被抗原,从而建立了鸭瘟病毒间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。经对不同血清样品的检测,表明此方法具有操作简便、敏感性高、特异性好的优点,特别适用于大批鸭群的抗体检测和流行病学调查,为合理免疫和疫病预防提供有效的技术手段。     

鸭瘟病毒及其核酸的电镜观察

对鸭瘟病毒及共核酸进行了电镜观察,纯化病毒经核酸酶降解杂核酸后,加入８．５ｍｏｌ／Ｌ的尿素释放病毒核酸,经水相法展开后用碳膜铜网点样,再经染色和真空喷镀,于电镜下观察。鸭温病毒呈典型的疱疹病毒形状,其核酸分子量估算约为９１．１×１０＾６道尔顿。     

小鹅瘟病毒地方株的分离与鉴定

对安徽省六安地区疑似小鹅瘟病死雏鹅进行剖检,对具有典型症状和病变的病死雏鹅脏器进行病毒的分离培养.用接种鹅胚的病毒增殖法,从病死雏鹩的脏器中分离到一株病毒.通过鹩胚致病性试验、鹅胚中和试验、雏鹅感染试验和琼脂扩散试验,初步鉴定所分离的毒株为小鹅瘟病毒,且该病毒具有较强的致病性.     

鸭瘟病毒转移质粒的构建

为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。     

鸭瘟病毒及其核酸的电镜观察

对鸭瘟病毒及共核酸进行了电镜观察。纯化病毒经核酸酶降解杂核酸后,加入８５ｍｏｌ／Ｌ的尿素释放病毒核酸,经水相法展开后用碳膜铜网点样,再经染色和真空喷镀,于电镜下观察。鸭温病毒呈典型的疱疹病毒形状,其核酸分子量估算约为９１１×１０６道尔顿。     

鸭瘟病毒强毒感染鸭肠道菌群的分子解析

应用ERIC-PCR法对鸭瘟病毒强毒株经皮下和口服感染20日龄鸭的十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠中细菌菌群的结构多样性和动态变化进行了检测.结果表明:对照鸭肠道内的菌群结构相对稳定,其中十二指肠和空肠的ERIC-PCR条带最少,盲肠最多;皮下感染24 h和口服48 h前,各肠段ERIC-PCR扩增条带没有明显变化,皮下感染48 h的鸭盲肠、口服感染72 h的鸭盲肠和回肠条带数量明显增加,随着感染时间的延长,条带数呈逐渐减少的趋势,死亡鸭各肠段的条带最少.对ERIC-PCR扩增条带中主带的测序结果表明,大肠杆菌、志贺菌、沙门杆菌等需氧菌或兼性厌氧菌成为皮下感染鸭的直肠、口服感染鸭的盲肠(回肠和直肠)的优势菌群;口服感染鸭的回肠中一个未知菌成为优势菌群.     

鸡毒支原体F株的毒力回归试验

将鸡毒支原体Ｆ株经培养基连续传３６代后的菌株培养物以鼻内和胸腔内感染接种的方式在ＳＰＦ鸡体内连续回传５代,然后分别取各回传代次的Ｆ株接种无鸡毒支原体和滑液支原体感染的小雏和ＳＰＦ鸡胚,同时以没经回的原始代次作为对照,比较各代次Ｆ株的毒力变化情况。试验结果表明,经回传ＳＰＦ鸡５代的各代次Ｆ株培养物接种小雏对鸡不致病,所有接种鸡气囊 未出现病变,和未经回传ＳＰＦ鸡的Ｆ株结果完全一致;经过回传的各代次Ｆ     

地高辛标记核酸探针检测鸭瘟病毒

鸭瘟是鸭、鹅和其他雁形日禽类的一种急性、热性、啦血性传染病．特，征足流行广泛，传播迅速．发病率高和死亡率大。由于鸭瘟引起死亡、淘汰和产蛋下降，给发病地区的商品鸭和产蛋鸭造成很大的经济损失，目前．国内检症、诊断该病常用的方法有病毒分离、琼脂扩散试骑、酶联免疫吸附试验等。国内尚未见地高辛标记核酸探针检测鸭瘟病毒的报道。     

鸭瘟病毒河南株gG基因的克隆与同源比较

鸭瘟是由鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)引起的鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病[1]。该病以流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率高为特征。鸭瘟病毒的研究起步较晚,其分子生物学方面的研究相对滞后。试验以鸭瘟病毒河南     

鸭瘟病毒基因组的提取和限制性酶切分析

利用高渗缓冲液裂解感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,加入核酸酶消化细胞DNA,再抽提病毒DNA的方法提取鸭瘟病毒基因组,结果证明,这种方法可以最大限度地消除细胞DNA的污染,得到纯净的病毒基因组DNA.用10种限制性内切酶对鸭瘟病毒疫苗株和分离株的基因组进行酶切分析,酶切产物电泳结果表明,Sma Ⅰ、Sal Ⅰ、Pst Ⅰ、Not Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ 7种限制酶产生酶切图谱二者几乎完全一致,EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ仅有个别条带不同,BglⅡ产生的条带迁移率差别较大,但条带数量相同.