多重PCR方法同时检测3种转基因作物外源基因

根据目前转基因作物常见的外源基因,选择出现几率较高的Ca MV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因,引物分别参照国家相关标准中的特异性序列,建立可同时特异性地检测3种外源基因的多重PCR检测体系。同时,对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。已知样品检测证明,此多重PCR体系具有良好的可靠性。利用此体系在对康定县境内出售大米、玉米样品检测中未检测相关基因。     

转基因产品CaMV 35S启动子基因实时荧光PCR检测方法中引物探针序列特征及影响

[目的]分析不同标准方法中CaMV 35S启动子基因筛查方法中引物探针位置关系,讨论以引物探针序列重组为阳性对照样品的可行性。[方法]收集国内标准方法中CaMV 35S启动子基因检测引物探针序列与CaMV参考序列比较,确定其引物探针位置特点。设计不同长度间隔序列的串联引物探针重组序列,检测其结果差别。[结果]CaMV 35S启动子基因实时荧光PCR检测方法中引物与探针区间隔序列对扩增结果影响甚微。[结论]通过将引物探针序列顺序串联合成重组序列可以作为特定实时荧光PCR检测方法的阳性对照。     

转基因玉米的定性PCR检测

根据玉米内参照基因zSSIIb和转基因玉米中常见的CaMV35S、NOS、Bt、hpt等基因的特异性结构,设计5对定性PCR引物,经定性PCR检测,可以准确地将转基因玉米的目的基因检出,说明这5对引物具有较高的特异性和准确性。由此建立了一套转基因玉米定性PCR检测方法,用于转基因玉米及其产品的筛查、抽检。     

SYBR Green实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数

采用SYBR Green I real-time PCR方法检测转基因大豆中外源基因35S边界基因的拷贝数,以大豆凝集素基因(Lectin)作为内参照基因,以转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,初始浓度为0.43μg·μL-1,进行5倍梯度稀释得到内参照基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线:y=-2.9915x...     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源,Ⅲ终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的cz值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的0值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为Y=-3．422x＋35．201,R^2=O．998;外源基因标准曲线方程为Y=-3．348x＋34．890,R^2=0．999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x＋35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x＋34.890,R2=0.999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]该研究为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

利用实时荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分

玉米是拥有转基因转化体数量最多的作物,多样的转化体增加了玉米中转基因成分筛查的难度。为了建立玉米中转基因成分的快速筛查方法,利用Taqman探针实时荧光PCR方法,通过对玉米样品中CaMV35S启动子(P-35S)和NOS终止子(T-NOS)2个元件组合的检测,完成对现有玉米转化体的筛查。建立的Taqman探针实时荧光PCR方法灵敏度可达到0.1%,检测时间较普通PCR方法缩短1h以上。同时提出了转基因玉米转化体鉴定路线图。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。     

CaMV35S启动子及其在转基因作物中的应用和检测

花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)是植物基因工程中应用最广泛的启动子之一,它在转基因植物的安全评价及检测研究中具有重要意义。了解CaMV35S启动子的起源及其发展情况,是开展转基因安全评价和检测的前提。文章对CaMV35S启动子的发展历史及其结构、功能作了简要描述,分析总结了CaMV35S启动子在转基因作物中的应用情况和目前对其相应的检测方法。针对目前在转基因作物中检测CaMV35S启动子存在的问题,认为今后转基因相关作物的序列信息及检测数据需要交流和共享,同时各个检测机构或实验室之间需要展开数据共享与共同验证,从而建立针对CaMV35S启动子的相对统一的标准检测方法。     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。     

转基因水稻中GUS蛋白质的检测及其表达特征

【目的】建立转基因水稻中GUS蛋白质的免疫学检测方法,并了解花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以细菌基因组DNA为模板,PCR扩增GUS基因后克隆到表达载体pET30a中,测序验证的重组子转入大肠杆菌表达菌BL21中,IPTG诱导获得重组表达的GUS蛋白质,用HIS-tag beads纯化后作为免疫原免疫小鼠制备GUS蛋白质特异的抗体,通过免疫印迹分析筛选高特异性的单克隆抗体,用Broadford法对重组的GUS蛋白质进行定量,对不同浓度的GUS蛋白质进行免疫印迹分析,绘制检测GUS蛋白质的标准曲线,通过与标准曲线的比较对水稻叶片中GUS蛋白质进行定量分析。提取不同时期、不同部位的水稻总蛋白质,包括苗期的地上部、地下部,分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶枕、叶片上部、叶片中部和叶片下部,孕穗期的茎、穗轴、叶鞘、叶枕、叶片、幼穗（长度分别为1、2、10和20 cm）,开花期的茎、穗轴、叶鞘、叶片、穗子,成熟期的茎、叶片、授粉后不同时期的种子（分别为授粉后10、20、30和40 d）、乳熟期的胚、胚乳和颖壳、成熟种子的全种子、胚、胚乳和颖壳以及不同时期的叶片和根部材料等。SDS-PAGE分离后用抗体检测其GUS蛋白质的丰度。【结果】筛选获得了高特异性的抗GUS单克隆抗体（编号为#27）,用该抗体检测转基因水稻中及重组的GUS蛋白质均呈现特异条带,没有可见的背景信号,用本研究建立的免疫印迹方法对重组GUS蛋白质的检测下限约为4 ng,可检出转基因水稻单粒大米2.5%样品中（约0.6 mg）的GUS蛋白质。在不同时期的转基因水稻叶片中GUS蛋白质的表达丰度基本稳定,而在水稻根部的GUS丰度随生长急剧减少,5叶期根中的表达量不到3叶期的三分之一,到6叶期检测不到GUS蛋白质。在水稻苗期叶片中,GUS蛋白质约占鲜重的0.02‰。另外,除分蘖期以后的根部之外,GUS蛋白质几乎在所有的水稻组织部位中呈组成型表达,只是不同组织中的表达量略有差异,如在孕穗期和开花期的茎及颖壳中的表达量较低。【结论】建立了具有应用价值的对转基因水稻中GUS蛋白质丰度检测的免疫印记方法。该方法特异性高、样品用量少、不依赖于GUS蛋白质的酶活性、测定结果易于在不同实验室间比较。证明了35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中基本呈组成型表达。     

气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCA T)和嗜水气单胞菌(Aeromonash ydrophila)的16S rRNA基因的保守区设计2对特异性引物.通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aer...     

Establishment of TaqMan Real-time Quantitative PCR Assay for Foreign Gene Copy Numbers in Transgenic Soybean

TaqMan quantitative PCR technique was used to detect the copies of exogenous CaMV35S flanks sequence in transgenic soybean. With soybean lectin as the endogenous reference gene, and gene complex DNA in...     

肉中两种致病菌的双重PCR检测方法的建立

为了建立肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PCR检测方法,以金黄色葡萄球菌nuc基因和单增李斯特菌hly基因为靶基因设计引物,通过优化退火温度和PCR反应体系,建立这两种菌的双重PCR检测方法,并分析其反应特异性和敏感性。进一步将该方法应用到人工模拟肉样中,并分析其敏感性。结果表明,建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法应用于人工模拟肉样中具有较高敏感性,其中金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌最低检测限分别为102和103 cfu.mL-1。该方法的建立为食品中多种致病菌的同时检测奠定了基础。     

大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法的建立

为同时检测患病大口黑鲈中不同属虹彩病毒感染和带毒情况,针对蛙病毒属和肿大细胞病毒属大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白（major capsid protein,MCP）基因的序列,分别设计1对特异性引物Rana-mcp F/R和Mega-mcp F/R,扩增产物片段大小分别为475 bp和262 bp。通过PCR反应体系的优化、反应的特异性和灵敏度试验,建立一种可以同时检测大口黑鲈蛙病毒属和肿大细胞病毒属虹彩病毒感染的双重PCR检测方法,最低DNA检测量分别为6.5 pg和14.5 pg。用此方法,对临床获得的15个大口黑鲈样品进行双重PCR检测和序列测定,获得5个蛙病毒属和1个肿大细胞病毒属虹彩病毒检测阳性结果。本研究中建立的基于MCP基因的大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法,可用于养殖大口黑鲈虹彩病毒病快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

杨属转基因植物PCR检测内标准基因的建立

为了建立适用于杨属植物转基因成分PCR检测的内对照系统,利用目前genebank中已公布的杨属植物的叶绿体DNArbcL基因的保守区域,设计了两对PCR引物:rbcL-1引物和rbcL-2引物,分别成功地对五大派10种杨属植物进行了rbcL基因片段的扩增,第一次建立了适用于杨属植物转基因成分PCR检测的内标准基因对照系统。其中rbcL-1引物适用的退火范围很广,在52.0～68.0℃之间均能得到特异性很强的扩增产物,这有利于其他检测项目(如35S启动子、NOS终止子、标记基因及目标基因)的引物随意搭配进行多重PCR检测,从而提高检测效率、缩短检测周期。     

Comparison of Two Real-time PCR Technigues for Quantification of GMO Contents in Highly Processed Products of Soybean

The RR soybean was quantitatively detected by ABI Prism 7300 sequence detector with PCR primers and fluorescence probes were designed according to the sequences of endogenous Lectin gene and exogenous CP4-EPSPS gene, and the PCR systems were based on SYBR GreenΙand TaqMan. The standard curve of °Ct between CP4-EPSPS gene and Lectin gene of the RR soybean in standard materials was generated and a linear regression equation was obtained. Quantification methods were optimized through two different real-time PCR chemistries, i.e. SYBR GreenΙand TaqMan, and the RR soybean contents were quantified in five standard samples and seven highly processed products by the two assays. Both methods are proved to be specific, highly sensitive and reliable for both identification and quantification of soybean DNA. The results indicate that the two optimized PCR system can be used for the practical quantitative detection of RR soybean in highly processed products.