蓖麻RAPD-PCR反应体系的正交优化

以东北蓖麻为材料建立蓖麻RAPD反应优化体系,用于蓖麻遗传多样性分析.用CTAB提取蓖麻基因组DNA,采用正交试验对影响蓖麻RAPD-PCR扩增的反应组分浓度进行优化.结果表明最佳的蓖麻RAPD-PCR反应体系(25μ1)中含10xbuffer 2.5μ1,模板DNA 4ng/μ1,dNTP 0.4mmol/L,引物0.321μmol/L及Taq酶0.1U/μ1.扩增程序为94℃预变性2min;94℃变性30s,35℃退火30s,72℃延伸1min20s;40个循环;72℃延伸5min.通过正交体系优化,获得了较优的蓖麻凡RAPD-PCR反应体系,为蓖麻RAPD分子标记提供了理论基础.     

蹄叶橐吾基因组DNA提取及RAPD-PCR体系的优化

为利用RAPD技术探讨长白山区橐吾属植物的遗传多样性,采用改良的CTAB法成功提取蹄叶橐吾的基因组DNA,并建立橐吾属植物RAPD-PCR反应的最佳体系.最佳体系容积为20μL,其中包括模板DNA20ng,引物10pmol/L,dNTP 300μmol/L,MgCl21.5mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U,不足部分用DW补充.反应程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸1min 30s,循环40次,最终72℃延伸10min.     

黑木耳菌丝体DNA提取及RAPD扩增条件的优化

对黑木耳菌株基因组DNA进行RAPD-PCR反应体系及扩增程序优化.结果表明,采用CTAB法快速提取到较高质量黑木耳基因组总DNA用于RAPD-PCR扩增,确定黑木耳基因组DNA RAPD-PCR最适25μL反应体系为:模板DNA浓度15 ng/μL,Mg2 浓度2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP浓度150μmol/L,10碱基引物浓度10 pmol,10×缓冲液,其余用重蒸馏水补充.扩增程序为:预变性94℃5 min,变性94℃1 min,退火36℃1 min,延伸72℃1.5 min,共40个循环,72℃最终延伸7 min.     

兰州百合DNA提取方法比较及RAPD体系的快速优化

以兰州百合鳞片和叶片为试材,采用改良CTAB法获得了高质量的基因组DNA。为优化兰州百合RAPD-PCR反应体系,利用正交试验设计,对兰州百合RAPD-PCR反应体系中的5种主要因素进行4水平共计16个组合设计,并选用3种反应程序,通过琼脂糖凝胶电泳结果分析,最终获得最佳反应体系为:20 u L反应体系中含30 ng模板DNA、0.5μmol/L随机引物、0.2 mmol/L d NTPs、2.25 mmol/L MgCl_2,及1.5U Taq DNA聚合酶。最佳反应程序:94℃预变性4 min;94℃变性1 min,36℃退火1.5 min;72℃延伸2 min;35个循环;最后72℃延伸7min。     

硅胶干燥罗布麻叶片DNA提取及RAPD反应体系建立

[目的]得到适用于罗布麻RAPD的最优体系.[方法]以伊犁地区新源县罗布麻硅胶干燥叶片为材料,采用TIANGEN试剂盒提取罗布麻基因组DNA,得到满足RAPD(Random amplified polymorphic DNA)分析的罗布麻基因组DNA.[结果]通过单因素优化实验,得到罗布麻RAPD分析的最佳反应体系为:Mg2+ (2.0mmol/L)、dNTPs(0.5 mmol./L)、primer(0.4 mmol/L)、DNA(1μL)、Tap酶取1μL、10×buffer取1μL,总反应体系为10 μL;扩增程序为:在94℃下预变性,然后进行42个循环(94℃变性30 s、38℃退火30 s、72℃延伸2min),最后在72℃延伸7 min.[结论]提取的罗布麻总DNA均有较高的质量,适合RAPD分析;Tiangen植物基因组DNA提取试剂盒对罗布麻基因组DNA有着良好的提取效果;对罗布麻RAPD-PCR中Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶和引物浓度进行优化,较为理想的各因子用量和扩增程序为:Mg2+(2.0 mmol/L)、dNTPs(0.5mmol/L)、primer(0.4 mmol/L)、Tap酶(0.5 U/μL)、DNA(40 ng),总反应体系为10 μL;扩增程序为:在94℃下预变性5 min,然后进行42个循环(94℃变性30 s、38℃退火30 s、72℃延伸2 min),最后在72℃延伸7min.     

珙桐基因组DNA的提取及ISSR-PCR体系的优化

采用改良的CTAB法提取珙桐基因组DNA,并采用正交试验设计方法优化其ISSR-PCR反应体系。结果表明：改良CTAB法提取基因组DNA的质量符合ISSR-PCR扩增反应的要求。最佳反应体系为：20μL反应液中含有2.0μL10×buffer、2.75 mmol/L Mg^2＋、0.125 mmol/L dNTPs、0.7μmol/L引物、0.75 UTaq酶和40 ng模板;PCR反应参数为：94℃5 min;94℃30 s,53.2℃45 s,72℃1 min,共40个循环;72℃7 min。     

茄子RAPD分子标记体系的建立与优化

采用改良的CTAB法提取茄子基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,比较筛选RAPD扩增体系的各影响因素,建立了茄子RAPD-PCR的最佳反应体系:20μL反应体系其中含25 mmol/L MgCl2 2.0μL1、0×PCR Buffer 2.0μL、10mmol/L dNTP 0.5μL5、U/μL Taq E 0.2μL0、.1μmol/L Primer 3μL1、0 ng/L模板DNA 3μL、灭菌双蒸水9.3μL。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,37℃退火1 min7,2℃延伸1.5 min4,5个循环;72℃延伸10 min后4℃保存。     

枣树基因组DNA提取及其RAPD体系优化

以不同生长期的枣和酸枣为研究对象,采用CTAB法提取枣基因组DNA;通过单因素5水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了枣和酸枣RAPD技术最优体系,即25μl反应体系中各组分含量为10×Taq Buffer+KCl 2.5μl;Taq DNA聚合酶0.04 U/μl;MgCl22.0 mmol/L;模板DNA2 ng/μl;引物0.3μmol/L;dNTP为0.2 mmol/L。适宜的扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃循环变性50 s,36℃退火50 s,72℃延伸1.5 min,38个循环;72℃延伸10 min。     

龙牙百合DNA的提取及ISSR-PCR体系的建立

[目的]研究龙牙百合总DNA的提取方法,建立优化的ISSR-PCR反应体系和程序,为种质资源研究奠定基础。[方法]利用改良的CTAB法提取龙牙百合基因组DNA,并对影响ISSR扩增反应的各因素进行优化。[结果]获得了高质量的龙牙百合基因组DNA;优化的龙牙百合ISSR-PCR反应体系为,25μl体系中含60 ng模板DNA,0.4μmol/L ISSR引物,2.0 mmol/L Mg2+,1.5 UTaq酶,0.2 mmol/LdNTPs;反应程序为,94℃预变性5 min;然后进行40个循环:94℃变性50 s,52℃复性45 s,72℃延伸75 s;循环结束后72℃延伸8 min。[结论]建立了适合于龙牙百合的ISSR-PCR反应体系及程序,为种质资源研究奠定了基础。     

苦楝RAPD反应体系的优化

以苦楝叶片提取的基因组DNA为材料,通过单因素多水平梯度试验,筛选DNA模板,Mg^2＋,Taq DNA聚合酶,dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立苦楝RAPD技术分析体系.结果表明：当基因组DNA浓度为60 ng/μL,镁离子浓度为3.0 mmol/L,dNTP浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/20μL,反应体系总体积20μL时,出现可辨认的清晰谱带.其扩增程序为：94℃预变性2 m in;然后38个循环（94℃变性30 s,37℃退火1 min,72℃延伸80 s）;最后72℃延伸8 min,4℃保存.     

西瓜RAPD-PCR体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,建立了西瓜RAPD分析的优化反应体系,即20μL反应体系中含有1×buffer,dNTP250μmol/L、Primer0.4μmol/L、MgCl22.0mmol/L、Taq酶1U和模板DNA20~40ng。适宜的扩增条件为94℃5min;94℃30s,37℃45s,72℃90s,45个循环;72℃5min;4℃保存。     

冷暖型小麦基因差异的最佳RAPD反应体系研究

为了建立小麦RAPD反应的最佳体系,保证反应结果的稳定性和可靠性,寻找小麦冷暖型基因差异,降低试验成本,在相同PCR扩增程序(94℃预变性5 min,94℃变性45 s,38℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,40个循环,72℃延伸10 min,4℃保存)下,对冷暖型小麦基因组DNA的RAPD扩增体系各参数进行比较筛选,创建其最佳反应体系为:25μl反应体系中,模板DNA 20 ng,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1 U,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,ddH2O 12μl,随机引物10 ng。     

均匀设计优化喜盐鸢尾ISSR-PCR体系

以新疆野生喜盐鸢尾DNA为模板, 采用U20(54)和U12(34)均匀设计表,通过4因素5水平和4因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素如Mg2+ 、dNT P、引物以及TaqDNA聚合酶浓度以及循环数和退火温度等进行优化筛选, 建立了适合喜盐鸢尾的最佳ISSR-PCR反应体系:在25 μL反应体系中,包括2.5 μL 10×PCRBuffer ,2.0mmol/L M g2+,250 μmol/L dNTP,0.1 μmol/L 引物,0.5U TaqDNA 聚合酶,40 ng模板DNA.扩增程序为 :94℃预变性3 min;接着进行40个循环:94℃变性45 s,52.1℃退火30 s,72℃延伸1.5 m in;循环结束后,72℃延伸5 min,4℃保存.     

新疆野苹果SSR-PCR 反应体系的优化

以4个新疆野苹果株系为试材,利用CTAB法提取DNA,对影响SSR-PCR扩增结果的主要因子设计了多梯度的优化试验。结果表明:新疆野苹果SSR-PCR反应体系(25μL)中含Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 5.0 ng、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+1.0 mmol/L、退火温度为60℃时效果最佳。最佳扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,65℃退火1 min,72℃延伸1 min,4个循环;94℃变性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。利用此反应体系对30份新疆野苹果进行SSR-PCR扩增和电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,表明该体系适用于新疆野苹果的基因连锁图谱构建和QTL定位。     

木豆随机扩增多态性DNA的反应体系研究

[目的]分析影响木豆RAPD-PCR反应中的主要因素,优化反应条件。[方法]以木豆品种ICPL87091为试材,以木豆基因组DNA为模板,通过对PCR反应体系中各种参数的优化设置,分析比较各种因素对RAPD扩增结果的影响,建立适宜的反应体系。[结果]试验得到了较为理想的适宜木豆的反应体系。优化的木豆RAPD反应条件为:模板DNA浓度30 ng,随机引物1.6μmol/L,dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)各0.2 mmol/L,Mg2+浓度2.0 mmol/L,Taq酶1.0 U,反应体积为25μl。循环体系为:先94℃1 min,35℃2 min,72℃2 min,5个循环;然后94℃30 s,37℃1 min,72℃1 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]利用这一反应体系可有效地进行木豆随机扩增多态性DNA分析,极大地提高了实验结果的可重复性。     

卷丹百合RAPD-PCR反应程序的优化研究

采用CTAB法提取卷丹百合的基因组DNA。采用正交设计和单因素试验相结合的方法,对卷丹百合RAPD—PCR反应程序中各影响因素进行了优化。结果表明：卷丹百合最佳的RAPD—PCR扩增程序为94℃预变性4min;94℃变性30s、39℃退火40s、72℃延伸1min,45个循环;72℃延伸10min。     

石榴ISSR-PCR反应体系的优化研究*

 以酸绿籽石榴为试材,对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行优化筛选。结果表明：25 μL　ISSR反应体系各组分的最适浓度分别为：1×buffer（不含Mg²⁺),1.5 mmol/L Mg²⁺,0.2 mmol/L dNTPs,TaqDNA聚合酶1.5 U,引物0.3 μmol/L,模板40ng。反应程序为：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,40个循环,最后72 ℃延伸10 min。该体系的建立为从DNA分子水平进一步研究石榴种质资源遗传多样性、系统分类、品种鉴定奠定基础。     

人参SRAP-PCR体系优化条件的建立

[目的]研究人参基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系。[方法]采用单因子实验方法探讨模板DNA、引物浓度、dNTPs浓度、Mg^2＋浓度等因素对PCR结果的影响。[结果]优化后的扩增程序为：94℃预变性2 min;94℃变性30 s,48℃复性30 s,72℃延伸1 min,共40次循环;72℃延伸7 min。最佳反应体系为：DNA模板30 ng,上下游引物浓度2.0μmol/L,dNTPs浓度0.3 mmol/L,Mg^2＋2.5 mmol/L,总体积25μl。[结论]建立了满足人参SRAP-PCR的优化扩增体系,为人参亲缘关系和遗传多样性SRAP分析提供快速、简便、重复性好的实验方法。