EST-SSR分子标记在茶树品种鉴别中的应用

从GenBank数据库中龙井43的EST序列中筛查EST-SSR位点,设计并获得了65对茶树(Camellia sinensis)EST-SSR引物.以鄂茶1号、龙井43、龙井群体、云抗10号、雪芽100、矮丰的基因组DNA为模板,对所设计的65对EST-SSR引物进行筛选.结果表明,65对引物均能扩增出清晰条带,有效扩增率为100％;其中有4对引物的扩增产物在6个样本间具有多态性,能用于6个茶树品种的品种鉴别.     

EST技术及其应用综述

 EST (Expressed Sequence Tag，EST)指的是一组cDNA的部分序列，一般长度为150~500bp，是由大规模随机挑取的cDNA克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。一个EST代表生物某一时期的某种组织或细胞的一个表达基因。主要综述了EST技术的原理方法以及EST技术在构建遗传学图谱、分离与鉴定新基因、基因表达谱的研究、比较基因组学的研究和制备DNA芯片等方面的应用。     

银杏EST SSR引物开发

为了开发银杏SSR标记,从NCBI的dbEST数据库中共下载21 604条银杏EST序列,经过去冗余处理和SSR位点搜索,共得到2 122条EST SSR序列。比较发现,二核苷酸和三核苷酸重复基元所占比例较高。利用TRA1.5软件共成功设计1 926对引物,随机选取100对引物进行合成和筛选,共选出22对具有多态性扩增条带的引物。22对引物在50个银杏品种上共扩增出78个条带,其中多态性条带34条。     

表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况

随着生物信息学的发展,表达序列标签(EST)在分子标记开发、新基因分离鉴定、基因表达谱分析、基因组功能注释、基因电子克隆等方面具有重要作用。简要介绍了EST分析的原理及其在基因识别、基因预测、物理图谱的构建、DNA芯片制备等方面的应用概况。综述了甲壳动物EST的研究现状,并对EST的应用前景进行了展望。     

整合玉米基因表达与遗传分析资料发掘耐渍性候选基因

对用cDNA microarray技术鉴定所得的玉米自交系Hz32(耐)与Mo17(敏)的根系在淹水胁迫早期响应的88个3倍差异表达ESTs进行电子定位,其中47条ESTs可分别排列到玉米10条染色体上;ESTs电子定位结果与玉米耐渍性QTLs图谱的整合发现,10条ESTs落入耐渍性QTLs区段内,并分别位于第1、2、4、5、9和10号染色体上。对这些ESTs的功能分析,推测其中3个基因为玉米耐渍性重要候选基因。整合基因差异表达与QTLs定位资料对筛选和发掘重要数量性状的侯选基因具有一定的指导作用。     

黄瓜EST中SSR的分布特征分析

从葫芦科基因组数据库下载513 801条黄瓜EST,经EST-trimmer软件和CD-HIT程序预处理,共获得381 022条非冗余EST。利用Perl程序MISA搜索到SSR位点15 665个,检出率为4.11%。单、二和三核苷酸重复为主导类型,占EST-SSR总数的95.98%。A/T、AG/CT和AAG/CTT作为单、二和三核苷酸的优势重复基元,分别占EST-SSR总数的21.43%、15.68%和19.27%。     

桑树EST—SSR引物开发

【目的】利用桑科的EST数据库进行桑树EST—SSR引物开发,为丰富桑树SSR数据库提供参考。【方法】下载NCBI中桑科的EST数据库,进行序列处理及拼接后,用SSRIT搜索其中的SSR位点,以Primer Premier 5．0设计引物,选用5个桑树品种各5株样品进行多态性引物筛选。【结果】下载的EST拼接后得到2008条拼接片段（contig）,共搜索到831个SSR位点,分布在799个contig中。二、三核苷酸重复基元是主导类型,分别占总SSR的66．06％和32．37％;TC／AG和CT／GA是二核苷酸优势重复基元,分别占二核苷酸总数的28．64％和25．87％。设计合成77对EST—SSR引物,其中46对能够扩增出有效条带;经多态性筛选,26对引物可扩增出多态性条带。【结论】利用桑属近缘属的EST序列进行桑树EST—SSR引物的开发是可行的;开发出的26对多态性引物可用于桑树遗传多样性分析和种质鉴定等。     

利用GenBank中大量葡萄EST序列分离有效基因的电子表达分析平台

 【目的】充分利用GenBank上的大量葡萄EST序列,建立本地化基因电子表达分析平台,实现基因表达模式的大规模快速分析。【方法】利用生物信息学方法对GenBank上的362 193条葡萄EST序列进行本地化及后续处理,建立电子分析平台,并通过RT-PCR技术对其电子分析准确性进行验证。【结果】建立了包含叶、花等11个组织类别和GA3等5个胁迫类型的基因电子表达分析平台。通过VvAG、VvCHS、VvF3H、VvLDOX等4个葡萄基因的RT-PCR和电子表达分析结果比较发现,平台预测效率较高,在预测EST来源数较多的果实、花序、花组织的表达效果较好,而对叶等EST来源较少的组织的预测效果需结合试验判断。随着dbEST库中源于葡萄各组织EST序列数量的大量增加,平台的预测效果将更加符合基因表达的实际情况。【结论】葡萄基因电子表达分析平台预测效率较高,为葡萄基因大规模快速表达分析以及重要相关信息的挖掘提供了很好的分析工具。     

日本沼虾EST-SNP的筛选及多态性检测

利用EST数据库开发SNP是筛选SNP标记的重要途径。本研究利用日本沼虾现有EST数据开发SNP标记—从NCBI获得8 458条EST序列;Seqclean软件去除序列中的载体、引物和接头等污染序列,得到8 453条EST序列;利用Quality SNP软件对预处理后序列中含有4条以上同源序列重叠群进行分析,在含有4条以上同源序列的1 055个重叠群中,筛选得到可靠SNP(Reliable SNPs)位点705个,较可信SNPs(High confidence SNPs)905个,潜在SNPs(Potential SNPs)1 144个。根据候选SNP位点设计28对引物,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,基因分型验证44个太湖个体,13对引物具有二等位基因多态性,观测杂合度和期望杂合度范围分别为0.259~0.745和0.255~0.728。结果表明,EST数据库中存在大量SNP位点,筛选的SNP标记可用于日本沼虾遗传学分析。     

正交设计优化烟草SSR反应体系

以烤烟品种K326为材料,探讨影响烟草SSR扩增的各种因素,建立能够稳定扩增烟草基因组的体系,为研究烟草重要性状的遗传基础及建立分子辅助标记育种的技术平台奠定基础.结果表明:在总体积为20 μl的PCR反应中,含35 ng模板DNA,1.5U聚合酶.MgCl2终浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为200 μmolVL,引物浓度为0.05 μmol/L时效果较好.     

烟草种质资源的遗传多样性分析

从200对SSR引物中筛选出69对条带清晰、多态性强的引物,对80份烟草种质资源材料(来自多个国家和地区)的全基因组DNA进行扩增,采用荧光ABI–3500 xl遗传分析仪进行多态性检测,结果 69对引物在烟草种质材料中共检测出503个多态性条带,平均每对引物可检测到的等位变异数为7.91个,观测杂合度(Ho)平均值为0.276 4,预期杂合度(He)平均值为0.574 7。Shannon’s信息指数I为1.082 6;Nei’s多样性指数H为0.571 1、遗传分化系数Fst为0.141 6,基因流Nm为1.515 3,遗传相似系数为0.55~0.90。说明80份烟草种质的遗传多样性相对丰富,居群间的遗传分化为14.16%,大部分位点均表现偏离Hardy–Weinberg平衡,杂合度不足,居群间基因交流少。     

烟草体细胞胚胎发生再生植株

以烤烟K326、红大、云85叶片诱导的愈伤组织为材料,在含不同激素配比的培养基上进行试验,研究其体细胞胚胎的发生能力.结果表明:不同品种之间体胚的发生能力存在较大差异,不同激素配比诱导体胚发生的频率也不同,K326、红大、云85体胚最高的发生频率分别为8.3%、47.4%和61.1%;最佳激素配比分别为2.0mg·L-1NAA+0.5mg·L-1BA、2.0mg·L-1NAA+0.2mg·L-1BA和2.0mg·L-1NAA+0.5mg·L-1BA.试验中观察到烟草体胚发育的各阶段,并最终再生成完整植株.     

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。     

香蕉穿孔线虫对烟草和芒果的寄生性和致病性

 【目的】利用从进口观赏植物上截获,并培养保存在胡萝卜愈伤组织上的香蕉穿孔线虫10个种群,研究香蕉穿孔线虫对烟草和芒果的寄生和致病性。【方法】采用温室盆栽接种方法,进行寄生和致病性测定。【结果】香蕉穿孔线虫在烟草和芒果根际的繁殖率Rf＞1,接种香蕉穿孔线虫的烟草和芒果植株生长缓慢、矮小,根系衰弱、变色腐烂,有明显受害症状。【结论】烟草和芒果是香蕉穿孔线虫新的适合寄主植物,香蕉穿孔线虫对这2种植物具有明显的致病性,不同种群的致病力有差异。     

腐熟花生壳在烟草漂浮育苗中的应用研究

为了筛选出烟草(Nicotiana tabacum L.)漂浮育苗替代基质配方,用腐熟花生壳、河沙、蛭石进行混配,采用配方对比育苗试验方法,研究了不同处理基质的出苗率、成苗质量和烟苗农艺性状差异,并进行了成本分析。结果表明,以腐熟花生壳与河沙体积比8∶2和7∶3的混配配方育苗效果最好,与商品基质差异最小,且成本较低,具备作为烟草漂浮育苗基质的条件。     

几种植物生长调节剂对苄嘧磺隆胁迫下烟草的生长作用

苄嘧磺隆是一种低毒高效安全的磺酰脲类除草剂,但由于其过度使用在土壤中所形成的残留同样对于后茬敏感作物会产生危害。本研究分析一些植物生长调节剂及其抑制剂对受到苄密磺隆残留危害的烟草生长的影响,设计不同的处理组与对照组在症状出现时间、植株长势以及恢复正常生长方面进行比较。试验中发现茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)及它们的抑制剂水杨羟肟酸(SHAM)、二乙基二硫代氨基甲酸二乙胺盐(DIECA)后烟草仍然会出现由于苄密磺隆残留导致的症状如叶片畸形、卷曲、质地脆硬以及黄化。但在其后生长调节方面,施用SA的处理组烟草长势最良好,在特定的试验时间段内(处理及施药后20d内)恢复正常生长的能力最好。相反SHAM与DIECA混合施用下的烟草长势不仅没有得到改善,长势甚至弱于仅用溶剂施用的处理组,且没有样本恢复正常生长。试验结果表明SA可以明显有利于受到土壤中苄嘧磺隆危害下烟草的生长。但是SA的施用方案有待进一步优化以实现更好的效果。     

烟草漂浮育苗替代基质研究

为了筛选出烟草漂浮育苗替代基质配方,采用花生壳、河沙、腐殖土、玉米芯、煤渣、食用菌废料等材料进行了混配,采用配方对比方法进行烟草育苗试验,研究了不同处理基质的理化性状及其对烟草出苗率、成苗率和农艺性状的影响。结果表明,花生壳与河沙以60∶40的体积比及花生壳与腐殖土以50∶50的体积比进行混配的配方处理育苗效果最好,与商品基质的差异最小,且成本较低,具备作为烟草漂浮育苗基质的条件要求。     

烟草甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析

为了对植物抗病虫基因工程研究提供依据,以辣椒凝集素基因为探针,通过电子克隆方法从烟草栽培品种K326中克隆甘露糖结合凝集素基因,并对其进行了序列分析。结果表明:从烟草栽培品种K326中克隆出NtMBL1、NtMBL2和NtMBL33种甘露糖结合凝集素基因;3种凝集素cDNA序列均包含完整的开放读码框,编码298个氨基酸,具备B-凝集素结构域,与辣椒凝集素蛋白的一致性较高。经SWISS-MODEL同源模建分析,NtMBL1、NtMBL2和NtMBL3的蛋白模型由8～9个β片层组成的β桶结构,具有与单子叶植物甘露糖结合凝集素相似的空间结构。     

移栽时期对烟草生长及产量、质量的影响研究

为探讨兴山县烤烟产区适宜的烟草幼苗移栽日期,设计了4个移栽日期处理,采用随机区组方法进行了小区对比试验。结果表明,兴山县烤烟产区在5月5日～5月20日之间进行烟苗移栽,则大田期烟草花叶病和赤星病均可在有效的控制范围内,并且烟株上部叶开片情况较好,总糖和还原糖的含量较为适宜,化学成分协调,产量和产值较大。因此,兴山县烤烟产区烟苗移栽日期应确定在5月5日～5月20日之间,单位面积经济效益才能最好。     

烟草WS38生长素结合蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以烟草WS38为材料,根据GenBank中登录的烟草生长素结合蛋白(ABP1)氨基酸序列设计引物,通过RT-PCR克隆了烟草WS38ABP1基因cDNA分子编码区,序列全长为564bp,可编码1条188个氨基酸的多肽.利用ClustalX软件对该序列翻译获得的多肽序列与报道的烟草生长素结合蛋白氨基酸序列比较,两者同源性为98.4%,存在2个氨基酸的差异,但差异氨基酸对ABP1结构和功能影响微弱.认为克隆的cDNA序列即为烟草WS38ABP1cDNA,不同品种烟草ABP1基因存在的核苷酸单位点多态性(SNP)造成了两者氨基酸序列的差异.