犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV) VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT - PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8h取其肝脏提取总RNA,进行RT - PCR方法扩增.[结果]在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)- CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定

利用pVAX1载体的表达元件CMV启动子和poly(A)多聚腺苷酸信号构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因(F)的重组犬腺病毒。首先,利用酶切、连接等实验方法构建了含CDV启动子F蛋白基因表达盒的转移质粒pVAXΔE3LPF。再以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建重组质粒pCAV-2-pVAXLPF,利用脂质体介导方法转染MDCK细胞,转染3次后,细胞出现了典型的犬腺病毒感染样病变。电镜负染和切片观察、酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明,成功构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因的重组犬腺病毒,表达的融合蛋白分子质量为72ku。在MDCK细胞上连续传30代试验表明重组病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遗传稳定性。     

犬瘟热病毒N基因原核表达质粒的构建

为了对N蛋白表达作为诊断用抗原、检测犬瘟热病毒(CDV)特异性抗体提供参考依据,以已构建的含犬瘟热病毒N基因的pMD18-N质粒为模板,利用特异性引物进行PCR扩增,得到1572 by的N基因开放阅读框,将所得N基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32a(+)-N,并转化至...     

应用重组PCR构建猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白融合基因

膜联蛋白A2是膜联蛋白多基因家族成员之一,在Ca2+存在时能与带负电荷的磷脂结合。最近研究显示,膜联蛋白A2在病毒感染方面发挥了重要作用。本研究应用RT-PCR和PCR方法分别获得了猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)。然后用重组PCR技术成功构建了膜联蛋白A2-EGFP融合基因,为研究膜联蛋白A2在病毒感染细胞中的定位和表达,以及病毒和宿主细胞相互作用奠定了基础。     

eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV₉病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,     

犬瘟热病毒甘肃株的分离和N蛋白基因遗传进化分析

采用Vero细胞从甘肃2008-2009年疑似犬瘟热感染病犬体内分离到8株病毒,通过RT-PCR方法扩增M蛋白基因初步鉴定所获得毒株均为犬瘟热病毒(CDV)。进一步通过RT-PCR方法扩增分离株的N蛋白基因,并进行序列分析。结果表明,8株分离株均为CDV,它们之间N蛋白基因的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为98.4%~99.7%、98.3%~99.6%;8株CDV分离株的N蛋白基因和TN、A75/17相应序列的核苷酸同源性分别为98.5%~99.5%、97.0%~98.0%,推定的氨基酸同源性分别为98.3%~99.2%、98.7%~99.8%;8株CDV分离株N蛋白基因和疫苗株(Onderstepoort和Snyder Hill)的相应序列的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为93.0%~94.0%、96.8%~98.3%。根据N蛋白基因所建立的遗传系统发育树可知这8株CDV分离株与TN的亲缘关系较近,而与疫苗株处于不同的分支上。说明从甘肃分离的CDV野毒株和TN由同一毒株演化而来,与疫苗株亲缘关系较远。     

犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

[目的]提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量.[方法]研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST - CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST - Sepharose 4B亲和层析柱对GST - CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定.[结果]大肠杆菌BL21 (DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600 =1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8h,GST - CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL.[结论]确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础.     

犬瘟热病毒水貂株H与F蛋白基因原核表达重组质粒的构建及表达

将克隆质粒pMD-18T-H和pMD-18T-F分别进行双酶切,获得纯化的H基因和F基因,在T4DNA连接酶的作用下,亚克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得原核重组质粒pET28a-H和pET28a-F.将原核重组质粒转化大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta2(DE3)中进行表达,SDS-PAGE结果显示H基因和F基因分别表达相对分子质量约为31 400和38 200的融合蛋白,Western-blot检测结果显示,表达蛋白均可与CDV标准阳性血清呈阳性反应,表明原核表达的CDV H蛋白和F蛋白在反应原性上具有与天然H蛋白和F蛋白同样的特性,可作为CDV诊断用抗原,为CDV的免疫预防研究奠定基础.     

犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定

参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。     

表达犬瘟热病毒核蛋白的重组犬2型腺病毒构建与包装

为构建表达犬瘟热病毒核蛋白的重组犬2型腺病毒,用MluⅠ和SphⅠ双酶切真核表达载体pVAXLPN,获得CDVN基因表达盒,将CDVN基因表达盒克隆入预先用SspⅠ酶切后的线性化质粒pVAXAE3中,构建含CDVN基因表达盒的转移质粒pVAX△E3LPN。用NruⅠ和SalⅠ双酶切转移质粒pVAX△E2LPN。回收E3区部分缺失的含CDVN基因表达盒的目的片段,定向克隆入同样酶切处理含CAV-2全基因组的质粒载体ppoly2-CAV-2中,构建E3区部分缺失的包含CDV N基因表达盒的重组质粒pCAV-2-CDVLPN。重组质粒pCAV-2-CDVLPN经AscⅠ酶切获得线性化基因组CAV-2-CDVLPN。此基因组与NruⅠ和Sal Ⅰ分别酶切CAV-2 SY基因组获得的片段混合,利用脂质体介导共转染MDCK细胞,重复转染3次后。出现典型CAV-2病变,经电镜观察和酶切鉴定,证明表达犬瘟热核蛋白的重组犬2型腺病毒包装成功。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白N基因的真核表达及鉴定

根据GenBank发表的犬瘟热病毒N基因全序列,设计合成了1对特异扩增CDVN基因的引物。以山东泰安分离的CDV-FOX-TA株细胞毒中提取病毒RNA来制模板,利用RT-PCR扩增出了1.6kb的N基因,将其克隆到pIREShyg载体上,构建了pIRES-N真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-K1细胞,通过潮霉素筛选得到阳性克隆,间接免疫荧光实验（IFA）鉴定N基因在CHO细胞中的表达,并用RT-PCR方法从转录水平证实N基因在CHO-K1细胞中的表达,最终建立了CHO/CDV-N细胞株,为犬瘟热病毒的血清学检测和基因疫苗的研制奠定了基础。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得Onderstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Westernblot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下基础。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得On-derstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Western blot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下了基础。     

串联IL-2的犬瘟热病毒F-H融合基因重组乳酸杆菌的构建与表达

为了研发犬瘟热乳酸杆菌载体疫苗,更好地预防犬瘟热,试验采用重叠延伸PCR(SOEPCR)技术扩增IL2-F-H融合基因,将IL2-F-H融合基因亚克隆至穿梭载体pSIP409上,构建pSIP-IL2-F-H重组表达载体,并电转化至植物乳杆菌NC8感受态细胞中,构建串联水貂白细胞介素-2(IL-2)的犬瘟热病毒(CDV)F-H融合基因重组乳酸杆菌;利用SDS-PAGE和Western-blot检测IL2-F-H融合蛋白的表达情况。检测表明,重组乳酸杆菌表达了分子量约为80.16kDa的IL2-F-H融合蛋白,且该融合蛋白能与CDV抗体发生反应,具有反应原性。     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。