大豆11S/7S球蛋白比值QTL定位及相关基因分析

11S球蛋白与7S球蛋白是大豆贮藏蛋白主要成分,对大豆营养品质及加工特性有显著影响,且11S球蛋白对大豆营养品质及加工特性影响优于7S球蛋白,两者蛋白含量呈负相关.因此,大豆11S/7S球蛋白比值性状相关QTL位点与候选基因挖掘尤为重要.研究选用181个株系染色体片段代换系群体(Chromosome segment substitution lines,CSSL),采用完备区间作图法(Inclusive composite interval mapping)作11S球蛋白与7S球蛋白比值QTL定位,获得3个与大豆11S/7S球蛋白比值相关QTL.在两个共识QTL区间内,获得6个候选基因,通过实时荧光定量PCR验证,Glyma.09G015100在低、高表型材料中相对表达量均高于对照材料,表明该基因在球蛋白表达过程中有促进作用.研究结果为大豆11S球蛋白与7S球蛋白比值QTL精细定位及适用于加工品种选育提供理论依据.     

九三大豆主栽品种专用特性分析

为考察现有主栽大豆品种的专用特性,推动黑龙江省专用大豆品种的种植,选取九三地区大豆主栽品种的7个品种,通过测定蛋白质、脂肪、氨基酸、7S球蛋白亚基含量、11S球蛋白亚基含量,初步探究大豆品种的专用用途。结果表明:从脂肪含量和水溶性蛋白比例上考虑垦鉴豆27、垦鉴豆28、北豆41适用于加工大豆油和豆浆,从豆腐产率和硬度方面考虑,大粒黄、黑河43用于加工湿豆腐,北亿5号用于制作干豆腐。     

大豆7S伴大豆球蛋白和11S球蛋白亚基分析

将大豆7S伴大豆球蛋白和11S球蛋白经粗提后用A-PAGE进行纯化,目的是为了简化分离步骤,提高蛋白纯度,并对其亚基进行SDS-PAGE分析。结果表明,提纯后的两种蛋白纯度均达到99%,在SDS-PAGE图谱中7S伴大豆球蛋白由三个亚基组成,其分子量分别为77 740 Da,72 123 Da和56 242 Da;11S球蛋白也由三个亚基组成,其分子量分别为40 459 Da,35 787 Da和17 505 Da。     

浙江省大豆种质资源蛋白亚基构成分析

以杭州国家大豆改良分中心保存的321份浙江省大豆资源为研究材料,利用SDS-PAGE电泳技术,对其贮藏蛋白中7S和11S球蛋白及其亚基的相对含量(占总蛋白比例)进行了系统的分析。结果表明：浙江省大豆资源7S蛋白亚基相对含量变化范围在0.152～0.371;11S蛋白亚基相对含量变化范围在0.428～0.794;11S/7S比值介于1.269～4.008,平均值为2.289,其中蛋白含量高于45.0%,11S/7S比值高于3.5的有7份种质。不同大豆资源蛋白亚基组成和相对含量存在显著差异。相关分析表明,11S与7S蛋白亚基相对含量呈极显著负相关。在试验中还发现4份大豆资源均表现为7S球蛋白α′,α亚基含量较低,并且在30 kD至17 kD间出现未知小分子肽。依据浙江省大豆生态区域划分,浙北地区大豆贮藏蛋白11S/7S比值平均值最高;浙南地区大豆7S和11S相对含量变异系数高于浙北和浙中地区。     

大豆种质资源贮藏蛋白亚基研究

利用线性梯度SDS-PAGE分析了国内外377份大豆种质资源贮藏蛋白亚基带型和含量差异。结果表明,大豆贮藏蛋白亚基SDS-PAGE带型基本相同,一般有20条以上,存在缺失现象。同一大豆品种不同亚基和不同品种相同亚基含量变异较大。11S球蛋白和7S球蛋白含量呈极显著负相关关系。11S/7S比值的最大值和最小值分别为3.70和1.34,平均值为2.36。国外的大豆品种间11S/7S值变异大于国内。野生大豆和栽培大豆贮藏蛋白SDS-PAGE带型基本相同,但是含量差异较大。从大豆种质资源中可以筛选出11S/7S较高的优质大豆种质。     

大豆球蛋白提取条件优化及7S和11 S亚基的鉴定

大豆球蛋白是豆粕饲料的主要营养成分之一,对豆粕饲料的营养品质有着重要影响,其中7S伴大豆球蛋白及11S球蛋白是大豆球蛋白最重要的成分。研究分析了在不同提取液,不同的pH,不同的温度,不同浓度的Tris-HCl提取液及不同料液比对豆粕大豆球蛋白提取的影响,并且对7S伴大豆球蛋白和11S球蛋白进行了分析。最终SDS-PAGE结果显示55℃、0．05 mol/L、pH9．0的Tris-HCl溶液在料液比为1∶10时能够提取较多的球蛋白,并且7S伴大豆球蛋白由3个亚基组成,其相对分子量分别为60466 Da,55029 Da和49043 Da,11S球蛋白也由3个亚基组成,其相对分子量分别为44634 Da,39779 Da和17952 Da。     

磷素对不同大豆品种7S和11S球蛋白亚基组成及含量的影响

【目的】研究不同磷素水平对不同大豆品种7S和11S球蛋白亚基组成及含量的影响。【方法】选用东农42（高蛋白品种）、合丰25（中间型品种）、东农46（高油品种）3个大豆品种作为试验材料,采用盆栽,在每千克土壤施N和K2O各为0.033 g基础上,设P1、P2、P3、P4 4个P处理（即每千克土壤分别施P2O5 0、0.033、0.067、0.100 g）,采用SDS-PAGE电泳法测定7S和11S球蛋白亚基组成和含量。【结果】3个大豆品种7S球蛋白由α′、α、γ、β4个亚基组成,11S球蛋白由酸性亚基和碱性亚基组成;各种亚基分子量在品种间差异不显著。同一品种不同处理间东农42和合丰25两个品种7S、11S球蛋白和各种亚基含量P3处理最高,东农46 P2处理最高;同一处理不同品种间7S、11S球蛋白和各种亚基含量始终是东农42最高,东农46最低,合丰25处于二者之间;3个大豆品种7S和11S球蛋白及各种亚基含量在品种间和施磷处理间差异显著。【结论】施磷对3个大豆品种7S和11S球蛋白各种亚基组成没有影响,对分子量影响很小。施磷对3个大豆品种7S和11S球蛋白和亚基含量有影响,适宜的施磷量有利于提高球蛋白和亚基的含量。     

大豆7S与11S球蛋白QTL元分析及候选基因挖掘

大豆蛋白作为重要营养来源,其含量在大豆种子中约占40%。7S球蛋白（b-伴大豆球蛋白）和11S球蛋白（大豆球蛋白）约占种子总蛋白70%,其含量直接影响大豆蛋白品质及特性。因此,大豆7S与11S球蛋白含量相关QTL定位与候选基因挖掘非常重要。研究调查国内外已报道的42个7S与11S球蛋白相关QTL数据,通过利用BioMercator ver.2.1软件对其进行元分析得到11个Meta-QTL区间。利用《京都基因与基因组百科全书》和基因本体数据库分析Meta-QTL区域基因,确定18个参与调控7S与11S球蛋白含量的相关基因作为候选基因,该候选基因分别参与植物生长发育、氨基酸生物合成等过程。其中1个基因被注释为编码2S白蛋白超家族蛋白,6个基因与蛋白质合成相关细胞器的生长发育相关,5个基因被注释为编码影响贮藏蛋白积累的转录因子家族蛋白,6个基因与贮藏蛋白运输的分子机制相关。研究结果对大豆7S和11S球蛋白相关QTL定位及分子辅助育种具有重要意义。     

滹沱河沿岸野生大豆种子β-伴大豆球蛋白表型的多样性

山西省原平市境内滹沱河沿岸分布有大量野生大豆。野生大豆种子蛋白质类型丰富,是重要的蛋白质资源。大豆种子蛋白质主要包括β-伴大豆球蛋白(7S球蛋白)和11S球蛋白,其中,β-伴大豆球蛋白主要由76 k D的α′,72 k D的α和52~54 k D的β亚基组成。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,筛选400份滹沱河沿岸野生大豆种质,发掘出5种关于β-伴大豆球蛋白的系列表型:对照型、α′亚基分子量偏高型、α′亚基分子量偏低型、β亚基上位缺失型、β亚基缺失型。结果表明,滹沱河沿岸野生大豆种子β-伴大豆球蛋白性状的多样性,揭示出野生大豆种子β-伴大豆球蛋白具有复杂的分子构成和遗传机制。     

豆腐凝胶成型机理研究进展

豆腐凝胶形成过程是豆腐加工关键环节。其形成机制目前普遍认为是大豆贮藏蛋白(包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)在加热条件下分子内部疏水集团暴露,聚集形成大豆蛋白聚集体;聚集体在盐离子、氢质子或酶等凝固剂作用下,形成致密、有序和稳定三维蛋白网络结构,呈宏观豆腐凝胶。豆腐凝胶形成受多种因素影响。本文综述大豆蛋白组成、豆浆热处理工艺和凝固剂使用等因素对豆腐品质和凝胶形成机理影响,旨在为豆腐凝胶成型理论探讨、加工工艺参数选择和新产品开发提供新思路。     

大豆7S球蛋白(α+β)-亚基缺失型种质的α-与β-亚基基因的测序与分析

 【目的】明确大豆7S球蛋白（α+β）-亚基双缺失特性是否是由于α-与β-亚基基因的缺失或变异引起的。【方法】聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和α-与β-亚基基因的PCR扩增、克隆、测序和序列比较。【结果】该种质α-亚基基因特异性引物的PCR扩增结果与对照基本一致,β-亚基基因的则与对照不同。α-亚基基因扩增片段与对照的同源性较高,为90.9%, 二者的区别主要存在于扩增片段的5′-端;β-亚基基因间的同源性较低,仅为53.1%。另外,在该材料β-亚基基因扩增片段的两端,检测到一对短的反向重复序列。【结论】该种质α-与β-亚基同时缺失的特性不是由α-与β-亚基基因的缺失引起的;α-与β-亚基基因的扩增序列与对照存在一定的差异,基因序列间的差异是否为导致α-与β-亚基缺失的直接原因,尚需进一步研究确认。     

Isolation and Structural Analysis of the Seed-Specific Promoter from Soybean

The promoter region (BCSP666) of β-conglycinin α-subunit gene from the genomic DNA of soybean Jilin 43 was isolated by PCR method. Sequencing analysis showed that the cloned fragment BCSP666 had the similar structure to the soybean seed-specific promoter β-conglycinin α'-subunit gene promoter and β-conglycinin β-subunit gene promoter, and it also contains many motifs that contribute to the seed-specific promoter activity. Based on this sequencing analysis, we deduced that promoter fragment BCSP666 had the seed-sepecific promoter activity. And then we constructed the seedspecific expression vector pBMI666 with the promoter fragment BCSP666 and △6-fatty acid desaturase gene from Mortierella isabellina. The △6-fatty acid desaturase is the rate-limiting enzyme of the desaturation of linoleic acid in the production of a human essential fatty acid, γ-linolenic acid(GLA). The production of γ-linolenic acid(GLA) was observed in soybean callus cells, which were transformed with this vector. This confirmed the activity of the activity fragment BCSP666.     

~(60)Co诱变晋大78后代贮藏蛋白亚基相对含量变异的研究

对晋大78号种子进行60Co辐射处理,以后代M3代为材料,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和分析,结果显示:晋大78及诱变后代贮藏蛋白亚基的组成基本相同,但是各亚基相对含量变异较大,变异系数均大于10%,变异类型丰富;11S/7S与11S球蛋白呈极显著正相关,11S与7S球蛋白呈显著负相关(r=-0.109,P<0.05),根据11S/7S的比值将诱变后代群体分为比值高(>2.6)、比值较高(2.0～2.6)、比值中等(1.0～2.0)以及比值低等(<1.0)4类,为选育11S/7S高的大豆品种提供理论基础和实践依据。     

大豆微核心种质蛋白亚基含量变异的分析

大豆蛋白品质及其加工特性均受到各亚基相对含量及11S/7S的影响,了解大豆蛋白亚基相对含量变异将对选育蛋白专用型品种有重要的指导意义。于2008-2010年对236份大豆微核心种质材料的大豆蛋白亚基相对含量的变异情况进行了分析。结果表明:大豆微核心种质资源中蛋白各亚基相对含量有广泛的变异,有很好的遗传改良潜力,α′、α、β、A3、A1A2A4、B亚基的变异系数分别为0.410、0.330、0.311、0.211、0.123、0.170,11S/7S变异系数为0.400。不同生态区各亚基在相对含量和遗传变异程度上存在差异,总体来说,A1A2A4、B亚基相对含量和11S/7S在北方一熟制春作大豆品种生态区(Ⅰ区)比黄淮海二熟制春夏作(Ⅱ区)大,Ⅰ区分别为0.220、0.403、2.616,Ⅱ区分别为0.212、0.370、2.343。α′、α、β、A3亚基相对含量在Ⅱ区比Ⅰ区大,Ⅱ区分别为0.064、0.090、0.153、0.070,Ⅰ区分别为0.062、0.086、0.127、0.061。α′、β、A3、A1A2A4亚基相对含量的变异系数在Ⅰ区比Ⅱ区大,Ⅰ区分别为0.549、0.270、0.259、0.193,Ⅱ区分别为0.435、0.262、0.254、0.185。α、B亚基相对含量的变异系数和11S/7S的变异系数在Ⅰ区比Ⅱ区小,Ⅰ区分别为0.333、0.184、0.249,Ⅱ区分别为0.348、0.216、0.331。因此,在Ⅰ区α′、β、A3、A1A2A4亚基相对含量具有更高的遗传改良潜力,在Ⅱ区α、B亚基相对含量和11S/7S具有更高的遗传改良潜力。     

不同大豆品种籽粒及其豆腐中蛋白质组分的研究

选用２３个春大豆和夏大豆栽培品种。调查单株粒重，测定豆腐产量性状，籽粒蛋白质含量和蛋白质各组分含量。研究表明：大豆籽粒中球蛋白，清蛋白，，谷蛋白，醇溶谷蛋白，２Ｓ，７Ｓ，１１Ｓ球蛋白含量分别平均为２７．５４３％，６．９５２％，５．２９２％，１．９０１％，４．８６２％，５．３７４％和１７．３１４％。籽粒蛋白质各组分含量变异系数大。豆腐湿重，豆腐干重，豆腐湿体积与籽粒中７Ｓ，１１Ｓ球蛋白，清蛋白含量呈     

大豆种子特异性启动子的分离及结构分析

 采用PCR技术从大豆品种吉林43基因组DNA中分离到大豆β-伴球蛋白α-亚基基因启动子片段（BCSP666）。序列比较和分析表明，这一启动子片段与其它两个大豆种子特异性启动子--β-伴球蛋白α′-亚基基因启动子片段和β-伴球蛋白β-亚基基因启动子--片段在序列结构上有很大的相似性，并具有多种种子特异性启动子所特有的序列元件，据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。Δ6-脂肪酸脱氢酶是亚油酸脱氢形成γ-亚麻酸的限速酶。将启动子片段BCSP666与深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）连接，构建种子特异性表达载体pBMI666。通过农杆菌介导法转化大豆子叶节，在转基因愈伤组织中表达了脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）,获得γ-亚麻酸，初步验证了启动子片段BCSP666的启动子活性。     

大豆地方品种豆腐产量、品质及有关加工性状的相关

以南方和黄淮地区大豆地方品种为材料,研究豆腐产量、品质及有关加工性状相互间的关系。研究表明,干豆腐产量与蛋白利用率、蛋白凝固率呈显著正相关;干、湿豆腐产量与脂肪利用率呈极显著正相关,而与残渣率、渣蛋白含量和渣脂肪含量都呈负相关。逐步回归分析结果,脂肪利用率、籽粒脂肪含量、全蛋白含量和蛋白利用率高的品种干豆腐产量高;而蛋白利用率高、残渣率低、百粒重大和豆浆蛋白量高的品种可能产生较高的湿豆腐产量。6个豆腐品质成分性状间多呈显著正相关,它们与脂肪利用率、蛋白利用率和蛋白凝固率都呈显著正相关,且相关系数较大。     

β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体的构建

【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构（Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA）的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400 bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,并进行PCR及双酶切鉴定。利用农杆菌介导法将带有p3301-PFNZ-α′-BADH 的菌株转化“吉农27”大豆植株,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,并对转基因植株α′-亚基基因的表达量进行RT-PCR。【结果】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,利用农杆菌介导法转化大豆得到7株阳性转化植株;Southern杂交结果显示,外源基因以1～2个拷贝整合于大豆基因组中;RT-PCR检测表明,β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的表达被明显抑制。【结论】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体,获得了α′-亚基基因被明显抑制的转基因大豆植株,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。