柑桔溃疡病菌致病性研究初探

从四川、湖北两省收集的柑桔病样分离出2个溃疡病菌株,经生物学和PCR鉴定后,分别针刺接种于纽荷尔脐橙、福本脐橙、卡拉卡拉脐橙和春见桔橙等4个柑桔品种;接种2 d后调查发病情况,使用DPS软件8.01的Duncan新复极差法进行分析.结果表明,接种后4 d是最佳观察时期,4个柑桔品种分别接种上述菌株后发病率无明显差异,老叶和成叶的发病率要高于嫩叶的发病率,叶片不同部位之间的发病率也基本相当,桔橙的抗病性要高于脐橙的抗病性.     

柑桔溃疡病菌离体叶接种检验法的研究

对柑桔溃疡菌的离体叶接种检验法进行了研究和技术规范。结果表明 ,离体叶接种法是一种效果直观可靠、操作简便易行的检验溃疡病菌的方法 ,其检测水平可达到 1.5 5× 10 3 -4 cfu/ml;其技术规范为 :供接种的柑桔品种应为甜橙类感病品种 (如脐橙 ) ,供接种的离体叶片以达到定型大小的新梢成叶最佳 ;采用针刺后滤纸片贴敷菌液接种 ,最适孵育温度为 2 8～ 32℃ ,最佳保湿方法为吸水纸保湿法。     

应用斑点酶联法检测柑桔溃疡病菌

用浓度为１０＾８ｃｆｕ／ｍｌ，Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｃｉｔｒｉ全胞活菌免疫家兔，得以效价为１／２５６０～１／１０２４０的抗血清，应用斑点酶联法（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）检测Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｃｉｔｒｉ表明，抗血清经交叉吸收后特异性高，适宜稀释倍数为１：１０＾４～１０＾６，检测灵敏度度要达１０＾４ｃｕｆ／ｍｌ。加有０．５％Ｔｗｅｅｎ２０或０．５％Ｔｗｅｅｎ８０或０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ－１００的ＴＢＳ液为适宜封闭液，     

利用双重PCR技术检测柑橘溃疡病菌

建立了柑橘溃疡病菌的双重PCR检测方法.根据柑橘溃疡病菌的基因片段OPM-12SCAR fragment(AF312370),设计特异性PCR检测引物,并结合rpf基因设计的引物对柑橘溃疡病菌和其近缘菌株、植物原性细菌的DNA进行了双重PCR检测方法的研究.该方法特异性强,菌液浓度检测灵敏度达到102CFU/mL,能够满足快速、准确诊断柑橘溃疡病菌的要求.     

应用斑点免疫技术快速检测柑桔溃疡病菌

应用改进的斑点免疫技术在国产微孔滤膜上检测柑桔溃疡病菌（Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓａｘｏｎｏｐｏｄｉｓｐｖ．ｃｉｔｒｉ）。结果表明，靶细菌检测下限为１×１０４细胞／ｍｌ，柑桔无症材料浸出液稀释（１２８倍）仍可检出。经柑桔叶面腐生黄单胞及近缘细菌交叉吸收，提高了多克隆抗血清特异性，能有效地避免假阳性。３种ＨＲＰ－标结结合物的效果为ＨＲＰ－ＳｐＡ＞ＨＲＰ－ＩｇＧ（鼠抗兔）＞ＨＲＰ－ＩｇＧ（羊抗兔）。封闭液采用ＴＢＳ＋０．１％曲拉通或０．５％吐温２０，吐温８０均可获得白色滤膜背景。对全国８省３８县５１８个柑桔无症样品ＤＩＡ检验结果，平均带菌率３１．８２％，符合实际病情。     

福建柑桔溃疡病菌分化的初步研究

以日本(XC25和 XC29)和南京(XC31)菌株作对照,对从福建柑桔主要栽培品种上分离的28个柑桔溃疡病菌株进行培养性状,形态、生理生化、血清学,噬菌体敏感性和致病性的比较研究。试验初步表明,福建的柑桔溃疡病菌属于毒力较强的 A 致病型,且具有一定的分化。试验还表明,柑桔品种的抗病性变化较大。有感病、中抗和抗病等各种类型。在研究溃疡病菌菌系分化时,应选择中抗品种作为鉴别品种,采用无伤痍接种法较好。     

番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测方法研究

根据番茄溃疡病菌ITS(16S~23SrDNA间隔区)基因序列,设计并合成了荧光PCR检测引物(Fan1和Fan2)及特异性检测探针(Fanprobe),对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株实时荧光PCR反应。结果表明,番茄溃疡病菌PCR产物出现强烈的特异杂交信号,而非番茄溃疡病菌均未出现特异荧光信号,证明这对引物及探针具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将番茄溃疡病菌DNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系可检出52.3 fg/μL的模板。     

PCR法快速检测柑桔溃疡病菌的简易制样技术

采用依据柑桔溃疡病菌独有蛋白基因的保守区段设计的特异性引物及其扩增体系进行测试。4种浸泡液中,浸泡液B的浸提效果最好,最佳浸泡时间为10～15min。浸提液进行加热灭活与不加热灭活处理,PCR扩增结果无明显差异。对于无症柑桔样品,浸泡液中加入终浓度为0．3％的Na2SO3可以降低植物色素、多元酚和铜制剂残留的Cu^2 等抑制PCR反应物质的干扰作用。样品浸提液经过离心处理,不仅可以有效浓缩靶细菌,提高检测灵敏度,而且可以除去PCR反应抑制物质,大大降低了检测的假阴性。     

应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究

[目的]设计出向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola - Cvetkovic)的特异性引物,建立该病菌PCR快速检测方法.[方法]用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物PHDF1和PHDF2,优化PCR反应体系.[结果]PCR反应体系为:25 mM MgCl2 2.4 μL,10 mM dNTP 0.3 μL,10 uM引物各1.5 μL,模板7 ng,最佳退火温度61.6C,建立了该病菌PCR检测方法.[结论]应用该方法检测供试的13个菌株,该对引物可以准确的将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来,该病菌的PCR扩增片段为326 bp.     

Comparison of PCR,DIA and Pathogenicity Assay for Detection of Xanthomonas axonopodis pv.citri,the Causal Agent of Citrus Bacterial Canker Disease

Polymerase chain reaction (PCR) approach based on newly designed primers, JYF5/JYR5, was applied for specific detection of Xanthomonas axonopodis pv.citri(Xac). The efficiency and reliability of PCR method were compared with dot immunobinding assay (DIA) and classical pathogenicity test techniques for detecting suspensions of pure cells of Xac and soaking sap of citrus tissues. Detection sensitivity of PCR was about 4.5 cells or 1.56 pg target DNA per reaction which was higher than that of DIA (ca. 450 cells per dot).These three techniques (PCR assay, DIA and Pathogenecity test) could always detect Xac from symptomatic citrus samples. Different performances were obtained from citrus materials without symptoms, and the positive detection frequency was PCR, DIA and pathogenicity test.     

3种杀菌剂对柑桔溃疡病菌的室内毒力测定

为筛选防治柑桔溃疡病的高效药剂,将23种常见商品杀菌剂分别稀释成200 mg/L,采用喷雾法进行室内抑菌试验,选择3种初筛抑菌效果较好的药剂进行室内毒力测定.结果表明,噻霉酮、农用链霉素、溴菌腈的抑菌效果较好,其EC_(50)分别为46.59、86.18、102.91 mg/kg,噻霉酮的毒性最强.结合供试药剂有效成分和作用机理的比较,确定农用链霉素效果最佳.     

木薯细菌性枯萎病病原菌致病力差异及其胞外酶活性的研究

为寻找与致病性有关的生化因子,在含有酶基质的培养基上测定12株木薯细菌性枯萎病菌(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis Vauterin,Kertrin& Swings,简称X am)5种胞外酶的活性,并结合菌株接种后的病斑平均面积进行相关性分析.结果显示,供试菌株的胞外淀粉酶与病斑面积呈正相关,其酶活性与病斑面积的回归方程为:y=0.0426x+4.9522,r值为0.9789,菌株的胞外酯酶和纤维素酶活性与病斑面积相关性不明显,没有检测到菌株胞外蛋白酶和胞外果肢酶的活性.菌株胞外淀粉酶在致病过程中起着比较重要的作用.     

柑桔溃疡病菌在武汉地区越冬期适存性的研究

采用栽种易感病的脐橙苗实测法和以供检材料的浸提液或高速离心浓缩浸提液针刺接种脐橙叶片的致病性检测方法,对柑桔溃疡病菌在武汉地区越冬期的适存性进行了研究。结果表明：柑桔溃疡病菌在武汉地区主要病株的病斑内越冬,也有少量能以潜伏侵染的方式在病株的未显症叶片内越冬,成为翌年的初次侵染来源;病原菌不能在田间的病落叶、土壤和杂草上越冬。     

湖北柑橘溃疡病菌的PCR鉴定及序列分析

选用引物JYF5/JYR5对湖北疑似柑橘溃疡病标本进行了PCR鉴定和确证,同时改进了DNA抽提方法,优化了PCR条件,并与南京柑橘溃疡病菌株进行分子克隆比较.结果表明,南京菌株NJ-XC分离物扩增片段与Silva等报道的相应序列相似性为99%(411/413);湖北标本菌株HB-X0扩增片段与报道的相应序列相似性为100%(413/413),二者存在一定的差异.此外发现引物JYF5/JYR5能扩增叶表的根癌土壤杆菌,其片段大小为575bp.     

利用qPCR技术检测柑橘溃疡病菌的灵敏度分析

以常规PCR为对照,分析了实时荧光定量PCR(q PCR)检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度,并对接种柑橘溃疡病菌后的冰糖橙样品进行了动态监测。结果显示,q PCR检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度比常规PCR高1~3个数量级,且常规PCR对柑橘溃疡病菌DNA的检测会受到寄主植物DNA的干扰,q PCR不受寄主植物DNA影响;对接种后冰糖橙样品的分析,q PCR即时就能检测到柑橘溃疡病菌,并能实时观察到柑橘溃疡病菌在寄主叶片的增殖情况,而常规PCR要接种后2 d才能检测到柑橘溃疡病菌。     

柑橘溃疡病拮抗放线菌筛选及其抑菌机理研究

[目的]明确保存的放线菌资源对柑橘溃疡病菌的抑制作用和抑菌机理.[方法]通过平板对峙培养法筛选对柑橘溃疡病菌Xanthomonasaxonopodis pv.citri）有抑制作用的放线菌菌株,并采用电导率法、考马斯亮蓝法和斐林试剂法测定拮抗菌株发酵滤液对溃疡病菌的影响.[结果]筛选出3个对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的放线菌菌株,抑菌圈直径达42.0～60.0 mm,且该3株放线菌发酵液能提高溃疡病菌菌液电导率,增加还原糖和蛋白质含量.[结论]3株拮抗菌能破坏柑橘溃疡病菌细胞膜完整性,增加细胞膜通透性,引起细胞质外渗.     

水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌的多重PCR检测体系开发

本研究设计水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌的专化性引物,建立了可同时检测这两种细菌的多重PCR检测体系。通过体系优化、特异性和灵敏度检查,结果表明：两对专化性引物X-b和X-t具有较高的特异性和灵敏度,对水稻细菌性条斑病菌液和水稻白叶枯病菌液的检测灵敏度分别为104 cfu/mL和105 cfu/mL;利用本研究建立的多重PCR体系,成功地从50种市售水稻种子中检测出1个水稻品种带有水稻细菌性条斑病菌,1个水稻品种水稻白叶枯病菌。本研究建立了多重PCR检测体系,为检疫部门控制这两种检疫性种传病害的入侵提供了有效检测技术和手段。     

PCR-based Assay for the Detection of Xanthomonas campestris pv. Mangiferaeindicae Causing Bacterial Black Spot in Mango

[Objective] This study aimed to develop a PCR assay for detecting Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae(Xcm) in culture and in planta. [Method] Primers(Xcm HF and Xcm HR) were designed based on the partial sequence of hrp B gene from xanthomonads to develop a PCR assay for Xcm. Furthermore, specificity and sensitivity of the primer pairs were analyzed in detection of genomic DNA and cell from Xcm. [Result] Amplication was positive only with genomic DNA from positive control ATCC11637 and 12 Xcm strains; no PCR products were amplified with genomic DNA from ten other xanthomonads and seven other bacterial species. The sensitivity of detection was 2.4 pg/μl genomic DNA, and 1.8 × 104CFU/ml cells. The primers also worked well for pathogen detection in direct PCR assays of Xcm colonies grown on liquid medium and in PCR assays of total DNA from leaf, branch and fruit lesions. [Conclusion] A PCR assay was successfully established for rapid detection of Xcm in culture and in planta.