鲎素的研究及开发利用

鲎是一种栖生于海洋的低等无脊椎动物。鲎素为鲎血液中抗菌肽的总称,研究表明鲎素具有抗菌、抑病毒、检测内毒素等多种作用。鲎素对人胃癌BGC823细胞、人肝癌SMMC7721细胞、人肺腺癌SPCAi细胞、人早幼白血病HL60细胞的增殖都有明显的抑制作用。对鲎素的研究为细菌耐药性、药物残留和抗HIV等医学难题的解决提供了新途径。近年来,由于对鲎资源的过度开发利用,这一资源已濒临灭绝。现在,对鲎资源的保护工作正在展开。     

鲎C因子的研究进展

鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素敏感的丝氨酸蛋白酶原,主要有6种结构域,能特异结合内毒素而被激活.对鲎C因子的结构与功能、基因工程研究及其应用前景进行了综述.     

从鲎试剂生产废料中提纯鲎素的方法研究

目的 建立从鲎试剂生产废料中纯化鲎素的方法.方法 用酸处理和sephdexG-50凝胶层析法从鲎试剂生产废料中提纯鲎素.结果 经凝胶层析纯化样品在SDS-PAGE中显示单一蛋白质条带.鲎素分子量约3kD左右.提取的鲎素能显著抑制大肠杆菌的生长,IC50为3.9mg/L.进一步研究显示,提取到的鲎素不仅抑制普通大肠杆菌的生长,而且可以显著抑制耐氨苄青霉素或耐卡那霉素的大肠杆菌的生长.结论 本文建立的方法可成功地从鲎试剂生产废料中提取到纯化的鲎素.     

鲎血试剂抑制大肠杆菌内毒素致死效能的试验研究

在应用鲎血试剂检测肉品及蛋品中的细菌内毒素时,我们为验证内毒素对于动物的致死效能,和鲎血试剂在动物机体内对细菌内毒素的作用是增强还是减弱毒性?进行了如下的试验。     

肌苷注射液细菌内毒素检查法的实验研究

采用最大有效稀释法,利用两个生产厂家的鲎试剂对两个生产厂家的肌苷注射液进行细菌内毒素检测,结果表明样品稀释50倍后,使用灵敏度为0.5 EU/mL的鲎试剂,对检查无干扰,可用于检查肌苷注射液的细菌内毒素。     

海洋远古生物鲎体内活性物质的研究

鲎具有强的体液免疫体系和血细胞免疫体系,在鲎体内现在已经发现40多种具有生物活性的蛋白质类物质,包括一系列凝固因子、蛋白酶抑制剂、抗菌多肽、抗菌蛋白等。笔者就鲎血淋巴中活性功能物质以及鲎天然免疫系统进行了综述。     

中国鲎幼鲎人工养殖饵料初步研究

选用沙蚕、菲律宾蛤仔肉、明虾肉、明虾肉海带混合、海带和初孵卤虫6组饵料投喂2龄期中国鲎幼鲎。试验结果表明:投喂初孵卤虫组2龄期幼鲎存活率最高,为71.43%,其他投喂组存活率不足20%;投喂初孵卤虫组的35只2龄幼鲎有12只蜕壳发育成3龄期幼鲎,其他投喂组均未出现蜕壳;投喂初孵卤虫组幼鲎湿重和头胸部宽增加明显,其他投喂组湿重与初始湿重相比略有增加,但头胸部宽无明显变化。说明初孵卤虫是2龄期幼鲎人工养殖的适宜饵料。     

鲎人工饲养技术的初步研究

鲎属海洋底栖的节肢动物，生活在浅海区，在繁殖季节洄游到潮间带挖穴产卵。过去主要把它作为食用，随着鲎试剂研制成功、并广泛应用于医药卫生、食品检验等方面。因此，对鲎的需要量越来越大。但鲎的生活史很长，如用杀鲎取血制备试剂，不仅不能满足常年生产的需要，而且会破坏资源。所以在大规模研制试剂的同时、开展人工饲养技术的研究就显得很有必要。本文从生态学的角度出发、探讨了盐度、放养密度、耗氧量、抽血量、抽血间隔时间和摄食量等因素对鲎的变形细胞数量和存活率的影响，为人工饲养管理和适时适量抽血提供了理论依据。     

底质对东方鲎幼体存活的影响

研究以人工授精培育的鲎幼体为材料,在模拟的海区生态环境下观察鲎幼体在海沙和海泥中的成活情况,并比较幼鲎的生长发育情况,结果发现:幼鲎具有钻入沙或泥的生活习性,且幼鲎在含沙或泥的海水比在普通海水中成活率显著提高,生长发育情况较天然水体更好.     

大有开发价值的珍稀名贵养殖品种——鲎

鲎又称中国鲎、鲎鱼，属暖水性海产珍稀名贵节肢动物，体长60厘米以上，每只重2，5-4．5公斤。鲎模样古怪，全身覆盖硬甲，背面圆突，腹面凹陷，眼在背上，口在腹下，腹部两旁有足6只，腹部末端有剑形尾巴，用以撑身跳跃和御敌防卫。     

鲎血水解液美拉德反应产物的挥发性成分研究

以制备鲎试剂产生的废料血浆为原料,经盐酸水解后,水解液进行美拉德反应,通过固相微萃取-气相色谱-质谱法(SPME-GC-MS)测定反应产物中的挥发性成分,分析了其呈香机理。结果表明,鲎血水解液在p H为8.0,100℃加热2 h,其美拉德反应的褐变程度最强,确定了39种挥发性成分,主要包括烃类5.13%、酮类1.47%、酸类2.64%、醛类14.08%、酯类1.24%、酚类0.84%、醇类4.33%及含氮化合物0.26%。该结果可为开发苯甲醛、食品香精及卷烟改良剂等方面提供参考。     

成熟中国鲎卵的营养成分分析

分别采用凯氏定氮法、索氏脂肪抽提称量法、反相液相色谱法及和相色谱-质谱法测定了成熟中国鲎卵中粗蛋白、粗脂肪、氨基酸及脂肪酸的含量。结果表明,中国鲎卵粗蛋白和粗脂肪含量分别为61.90%和15.82%;鲎卵至少含有16种氨基酸,其中异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)和天冬氨酸(Asp)含量较高,占氨基酸总量的60%以上;鲎卵至少含18种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸(UFA)有7种,高度不饱和脂肪酸(HUFA)4种,分别占总游离脂肪酸含量的60.71%和13.15%。     

中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2＋浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系（引物为中国鲎微卫星引物）.并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系：总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2＋2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件：模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

中国鲎同工酶组织器官特异性表达

采用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了中国鲎6种组织器官（肝胰腺、心脏、肠、鳃、肌肉和黄色结缔组织）的乙醇脱氢酶（ADH）、山梨醇脱氢酶（SDH）、酯酶（EST）、过氧化氢酶（CAT）、天冬氨酸转化酶（AAT）、苹果酸脱氢酶（MDH）和苹果酸酶（ME）等7种同工酶的活性和分布,并对其酶谱的表型进行了分析.结果表明,中国鲎的同工酶系统存在不同程度的组织特异性.乙醇脱氢酶在鳃和黄色结缔组织中不表达;山梨醇脱氢酶在鳃中不表达;酯酶、过氧化氢酶和苹果酸脱氢酶在6种组织器官中均有表达,但表达活性存在差异;而天冬氨酸转化酶Aat-1位点在鳃中不表达.     

中国鲎3个地理群体遗传多样性的等位酶分析

应用等位酶技术对漳浦、连江和温州3个地理群体的中国鲎遗传多态性进行分析.实验结果发现：6个酶系统的10个位点中有6个为多态性位点,共获得21个等位基因;大部分位点在3个群体中偏离Hardy-Weinberg平衡;在物种水平上,有效等位基因数为1.635,观察杂合度为0.456,期望杂合度为0.306,香侬指数为0.486,表明中国鲎的遗传多样性较高;F-统计量（FST）平均为0.0475,表明中国鲎遗传差异主要存在于群体内;遗传一致度平均为0.969,遗传距离平均为0.0315,表明中国鲎群体间遗传分化较低;基因流平均为5.0120,显示群体间存在较大的基因交流.由此认为3个群体属于同一个繁殖群体.在进行鲎物种保护的同时,要加强对其遗传多样性的保护.     

紫外线诱导大肠杆菌产生对鲎素抗药性菌株的研究

探讨经过紫外线诱变能否筛选出抗鲎素的大肠杆菌突变菌株以及突变菌株对抗生素敏感性的变化.以大肠杆菌JM109和ATCC25922为研究对象,通过紫外线诱变技术对出发菌株进行诱变,以相应的出发菌株作对照,并通过鲎素浓度梯度平板法对大肠杆菌进行初筛后,对初筛到的抗鲎素菌株进行亚抑菌浓度鲎素的连续传代诱导和抗生素对初筛到的抗鲎素菌株进行敏感性测定.结果表明,采用紫外诱变和鲎素浓度梯度筛选的方法,从中筛选到低抗鲎素的大肠杆菌ATCC25922 3株;通过抗生素对此3种低抗鲎素菌株进行敏感性测定,表明抗鲎素菌株对苄星青霉素有显著抗药性,而对盐酸左氧氟沙星仍然敏感.对于大肠杆菌JM109菌株,经过紫外线诱变后,未诱导出抗鲎素菌株.     

鲎源抗菌肽对大肠杆菌基因组DNA和RNA作用的分子机制

为了探讨鲎素对细菌基因组DNA和RNA作用的分子机制,采用琼脂糖凝胶阻滞电泳、荧光和紫外光谱的方法研究了鲎素对细菌基因组DNA和RNA的影响,结果表明鲎素能够与大肠杆菌基因组DNA发生作用,并呈浓度依赖关系,浓度越高对细菌基因组DNA损伤越大;鲎素也能与基因组DNA和RNA结合,抑制其迁移。鲎素与基因组DNA的结合方式有待进一步研究,此结果为在分子水平上深入了解鲎素的杀菌机制提供重要的理论依据。     

鲎素对几种常见基因工程菌的抑杀研究

采用肉汤微量稀释法和MTT法分别测定了鲎素对基因工程菌大肠杆菌BL21、枯草芽孢杆菌WB800、枯草芽孢杆菌BS168、酵母菌GS115、里氏木霉QM9414的MIC(最小抑菌浓度)及其MBC(最小杀菌浓度)值.结果表明,其MIC值分别为10、10、10、20、40 μg/mL,MBC值分别为20、20、20、40、80μg/mL.鲎素对上述5种常见基因工程菌均有不同程度的抑杀作用,考虑到鲎素基因表达量低甚至不表达,很可能是由于鲎素对宿主的抑杀作用,相比于其他基因工程菌,认为丝状真菌里氏木霉QM9414作为鲎素的表达宿主有比较大的潜能.     

猪亚利桑那菌的毒素鉴定及其对小白鼠致病作用的病理学观察

将猪亚利桑那菌培养后离心、冷冻,以小白鼠为试验动物进行细菌毒素鉴定,结果确定猪亚利桑那菌仅有内毒素;用鲎试剂测得其细菌内毒素含量大约为0.125 EU/mL。取10只健康小白鼠观察猪亚利桑那菌对动物的致病性。小白鼠临床症状明显,眼内有脓性分泌物;病理组织切片结果发现,肝细胞界限不清,胞核大小差异较大;脾脏内有大面积出血区;肾小管上皮细胞肿胀,部分胞核消失;心肌纤维肿胀、断裂;由此可见猪亚利桑那菌对小白鼠有很强的致病性。     

鲎血清中游离氨基酸和脂肪酸含量分析

利用反相液相色谱法和气相色谱-质谱法分别测定了鲎血清游离氨基酸和脂肪酸含量.结果显示,鲎血清中至少含有12种游离氨基酸,含量较高的是甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和亮氨酸(Leu),其含量占氨基酸总含量的75%以上;脂肪酸有17种,其中饱和脂肪酸(SFA)10种,不饱和脂肪酸(UFA)7种[有3种是多不饱和脂肪酸(HUFA)],UFA和HUFA分别占总游离脂肪酸含量的52.82%和4.86%.