猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,获得了3株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7,其染色体平均数为98～103,间接ELISA检测3株细胞培养上清效价分别为1:3125、1:3125、1:15625,小鼠腹水效价分别为1:390000、1:390000、1:1950000.ELISA结果显示,1C7A4、4F3F5和4G87F仅与融合表达的PCV2-Cap蛋白反应,而与PET-32a载体表达的蛋白不反应.相加ELISA结果显示3株单克隆抗体对应两个不同的病毒抗原位点.间接免疫荧光结果显示,1C7A4、4F3F5和4G8F7能与PCV2发生反应,而不与PCV1发生交叉反应.结果表明所获得的3株单抗是PCV2型特异性的,为PCV1和PCV2鉴别诊断方法的建立奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体的制备与免疫学特性测定

利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB／c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株,分别命名为4C9、5D10、5F12,其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1：64～1：1024,腹水的效价为1：3200～1：10240,IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明,这3株McAb均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明,5D10和5F12具有病毒中和活性,中和效价分别为1：40和1：80。5D10相对亲和力大于5F12,3株细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体,表明抗GP5蛋白中和性McAb制备成功。     

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E．coli O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎,免疫BALB／c小鼠,制备免疫脾细胞;与SP2／0骨髓瘤细胞融合后,获得7株分泌抗E．coli O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株,分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3,Ig亚类分别是IgG2ak、IgG2aK、IgG1K、IgMK、IgMh、IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测,E7和F1细胞培养上清液的效价为1．6×10^3,腹水效价均为1×10^11;C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×10^2,腹水效价均为1×10^3。相加ELISA结果显示,F1、G9和G113株mAbs对应相同的抗原表位,而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性,7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Westernblotting表明,c3、E7和F13株mAbs在蛋白分子量28×10^3处有特异性条带,而其它4株mAbs则未显示蛋白带。     

一株禽腺病毒4型Fiber2蛋白单克隆抗体的制备

制备禽腺病毒4型（FAdV-4）Fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,将重组蛋白FAdV-4 Fiber2纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,分离脾脏中的淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选得到10株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株1B5F1、1B5G11、1B5C1、1B5D2、1B5E3、1B5F3、1B5E4、1B5G4、1B5A8、1B5G8,取分泌抗体水平最高的1B5F1细胞株制备腹水,利用斑点杂交（Dot blot）和间接免疫荧光试验（IFA）进行特异性检测。结果表明,成功制备10株杂交瘤细胞株;制备的腹水能与FAdV-4 Fiber2蛋白及FAdV-4攻毒后的鸡肝组织产生特异性反应,证明成功制备了FAdV-4 Fiber2蛋白特异性单克隆抗体。     

血清4型禽腺病毒penton蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备和鉴定血清4型禽腺病毒（FAdV-4）五邻体（penton）蛋白单克隆抗体,为深入探究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用及为抗原检测试剂研发提供抗体材料。【方法】以原核表达的FAdV-4 penton重组蛋白免疫6～8周雌性BALB/c小白鼠,加强免疫3次后,取鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,通过penton-酶联免疫吸附剂测定（ELISA）和FAdV4 virus-ELISA方法分别筛选阳性杂交瘤细胞株,对筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚类鉴定、特异性和广谱性鉴定及间接免疫荧光和稳定性试验。【结果】亚类鉴定结果表明,筛选获得7株能稳定分泌抗FAdV-4 penton蛋白的杂交瘤细胞株（1D11、2B3、2C4、2C9、6B3、8F12和8G11）,其轻链均为Kappa链,重链3株为IgG1,4株为IgG2b;特异性检测结果表明,7株单克隆抗体只与FAdV-4反应,不与其他11种血清型FAdV及NDV、ARV、EDSV和IBV等常见禽病病原体发生交叉反应;广谱性鉴定结果表明,7株单克隆抗体均可与19株FAdV-4分离株结合,广谱性好;间接免...     

鸡p15INK4B蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

用制备并纯化的鸡p15^INK4B蛋白免疫BALB／c小鼠,制备了p15^INK4B蛋白的单克隆抗体,并进行了鉴定。结果表明：2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株105和3F5分别属于IgG1和IgM抗体亚类;培养上清的效价分别为1：820和1：680,腹水的效价分别为1：4×10^6和1：7×10^5;2株单克隆抗体亲和力常数分别为3．13×10^9L/mol（1C6）和1．24×10^8L／mol（3F5）,相对亲和力1C6〉3F5,且具有不同的抗原识别位点;Westem-blot鉴定表明,1C6和3F5这2株单克隆抗体均能与原核表达纯化的和杆状病毒表达的p15^INK4B蛋白结合,而不与其他蛋白结合,说明本研究成功制备了鸡p15^INK4B的单克隆抗体,可作为深入研究鸡p15^INK4B蛋白的功能提供特异的抗体材料。     

伊氏锥虫单克隆抗体制备及性质研究

本研究运用杂交瘤技术成功地分离了B_8、I_2两株分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体(McAb)的细胞系。首先用可溶性伊氏锥虫抗原接种BALB/C小鼠,经过一定的免疫程序后,取其脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,经过两次有限稀释法克隆,用ELISA方法选育出B_8、I_2两株产生抗伊氏锥虫McAb的细胞株。用琼脂扩散法与标准羊抗鼠亚类血清反应证明两种McAbs皆隶属于IgG_1亚类。细胞株在连续传代及冻存复苏后其分泌抗体能力稳定;经多种血清学反应证实,这两株McAb与伊氏锥虫可溶性抗原不起凝集反应,只有ELISA反应阳性。pH稳定试验表明,B_8株McAb比I_2株稳定。     

WSSV单抗的制备及其在红螯螯虾病毒病检测中的应用

将提纯的感染红螯螯虾的WSSV,免疫BALB／c小鼠,三次免疫后取其脾细胞与SP2／0融合．间接ELISA筛选,阳性克隆经3次亚克隆后,共获得7株针对WSSV的特异性单抗,分别命名为E2、C2、E3、G3、C4、D5以及F10．细胞上清ELISA效价为1：1600—1：6400．抗体亚类鉴定结果表明：E2、G3、C4属于IgG1,C2、D5、F10属于IgG3,E3属于IgG2a亚类;单抗热稳定性试验表明7株单抗均是热稳定的．选取单抗G3和F10进行病毒中和试验,结果表明：在适宜的抗原浓度下,两株单抗均有较好的中和能力．选取单抗G3作为一抗建立了间接ELISA方法,通过对人工感染红螯螯虾WSSV的测定,初步证实该单抗可用于WSSV的检测．     

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ.分泌抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E.coli O157:H7(EHEC-O157:H7)用甲醛灭活、超声破碎,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞;与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,获得7株分泌抗E.coli O157:H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株,分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3,Ig亚类分别是IgG2aκ、IgG2aκ、IgG1κ、IgMκ、IgMλ、IgMκ和IgG2aκ.用间接ELISA检测,E7和F1细胞培养上清液的效价为1.6×103,腹水效价均为1×1011;C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×102,腹水效价均为1×103.相加ELISA结果显示,F1、G9和G11 3株mAbs对应相同的抗原表位,而其它4株对应不同的抗原表位.用间接ELISA分析特异性,7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应.Western blotting表明,C3、E7和F1 3株mAbs在蛋白分子量28×103处有特异性条带,而其它4株mAbs则未显示蛋白带.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)的单克隆抗体,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)GP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和NS0浆细胞瘤细胞进行融合,经间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆化获得3株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的(mAb)杂交瘤细胞株,命名为4B7、2C5和2E4。间接免疫荧光(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)结果显示,3株mAb均与感染PRRSV BJ 4株的Marc 145细胞特异性反应,表明其可识别天然病毒蛋白。mAb的Ig亚类均为IgG1,细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1∶256和1∶51 200,Western blot分析表明,mAb均特异性识别PRRSV GP5蛋白。     

抗牛型结核分支杆菌单克隆抗体的制备和鉴定

运用杂交瘤细胞技术,以牛型结核分支杆菌免疫Balb/c小鼠,用其超声波裂解液筛选杂交瘤细胞,得到了2株能稳定分泌抗牛型结核杆菌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5D4和4C3,并对它们的特性作了初步鉴定.经鉴定,2株单克隆抗体均为IgG1亚类.腹水经ELISA检测,效价可达1∶1×104~1∶1×105,同时分析了2株单抗的抗原位点,结果表明2株单抗针对不同的抗原位点.单抗的特异性试验结果显示,2株单抗与大肠杆菌,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌等均没有反应,但都与人型结核分支杆菌有不同程度的交叉反应.并应用免疫胶体金技术制备牛结核杆菌胶体金快速诊断试纸条做应用性鉴定.该试纸条只与结核杆菌发生反应,而不与沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、李氏杆菌等发生交叉反应.该试纸条最低能检测出浓度为1×106个/mL的牛结核杆菌菌液,有较高的灵敏度.     

鸡T细胞特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以鸡胸腺细胞免疫ＢＬＡＢ／ｃ小鼠,进行细胞融合,获得了１５株杂交瘤克隆株,其中有５株（１Ｂ６、１Ｃ５、３Ｅ４、９Ｈ６、５Ｅ１０）杂交瘤克隆抗体（ＭｃＡｂｓ）只对鸡胸腺细胞和外周血Ｔ细胞发生特异性反应。ＷｃｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析表明,这组ＭｃＡｂｓ反应的膜抗原分子量为６０～６５ＫＤ,该抗原分布于６３３～７２４％的胸腺细胞、１７３％～２４５％的脾细胞,２３％～２７％的外周血淋巴细胞,而法氏襄细胞的反应性不超过１３％。以此ＭｃＡｂｓ作诊断试剂,对禽类Ｔ细胞分离、纯化及Ｔ细胞亚类鉴定提供了重要的研究手段。     

金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体的制备

为获得稳定性好、特异性强、效价较高的抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体,用热灭活的金黄色葡萄球菌wol-04菌体抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,以金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为筛选抗原进行克隆筛选,并对各株单抗的生物学特性进行分析和鉴定.结果表明:试验获得了3株稳定分泌SPA单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中单克隆抗体3B11、4F7为SPA表面抗原表位的单克隆抗体,与金黄色葡萄球菌wol-04菌体和SPA有较强的免疫反应性,免疫球蛋白亚类分别为IgG1和IgG3,具有稳定性好、特异性强、效价较高的特点.     

可阻断IBDV感染的抗CEF膜蛋白单克隆抗体的筛选

 【目的】利用细胞融合技术及细胞免疫组化方法,筛选可特异性阻断鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染的抗鸡胚成纤维细胞（CEF）膜蛋白单克隆抗体,为进一步研究IBDV的CEF受体奠定基础。【方法】用CEF细胞免疫Balb/c小鼠,经细胞融合获得杂交瘤细胞上清。单层CEF用杂交瘤细胞上清孵育2 h后接种IBDV,病毒感染后固定细胞,先后与F22-EA6-Biotin及Streptavidin-HRP进行反应,最后用AEC染色,显微镜下计数,统计感染细胞减少的百分率以判定单抗上清阻断IBDV感染的效果。【结果】利用细胞组化的方法,共计检测了768株杂交瘤细胞上清,6株（1A5、1H11、2B12、3G1、4D10和4B8）显示有阻断IBDV感染的效果,其中4B8可完全阻断IBDV对CEF的感染,该单抗针对的CEF膜蛋白很有可能是IBDV的细胞受体。【结论】筛选到的抗CEF膜蛋白的单抗可以阻断IBDV感染CEF,表明所建立的方法具有较高的敏感性和特异性。这些单抗可以用于进一步研究IBDV的CEF细胞受体。     

Screening for Monoclonal Antibodies Against the Membrane Proteins of Chicken Embryo Fibroblast Blocking the Infection of IBDV

This article aims to establish an efficient assay for screening monoclonal antibodies （McAbs） against the membrane proteins of chicken embryo fibroblast （CEF） for further studies of the cellular receptors of infectious bursal disease virus （IBDV）. McAbs against the membrane proteins of CEF were prepared by cell fusion. The monolayer CEF pre-incubated with the CEF-specific McAbs for 2 h were infected with IBDV and incubated with F22-EA6-biotin postinfection. Then, the cells were reacted with streptavidin-horseradish peroxidase （HRP） and finally stained by 3-amino-9-ethylcarbazole （AEC）. The inhibitive percentage of IBDV infection was calculated by counting the IBDV-infected cells to determine the inhibition efficiency of the CEF-specific McAbs. Compared with the control cells, the IBDV-infected cells pretreated with CEF-specific antibody significantly decreased; supernatant fluids of a total of 768 hybridomas were analyzed. The results of immunohistochemistry assays showed that six of them （1A5, 1H11, 2B 12, 3G1, 4D10, and 4B8） have the abilities to block the infection of IBDV to CEF, among which 4B8 can perfectly block the infection. This novel method is a sensitive and specific assay for the screening of CEF membrane protein-specific McAbs, which can block the infection of IBDV to CEF, and these McAbs can be used for the further investigations of the cellular receptors of IBDV.     

副结核分枝杆菌McAb的某些特性鉴定

以超声波粉碎的副结核分枝杆菌地方株Ｃ２抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，经与ＮＳ－１骨髓瘤细胞三次融合，获得了３株能稳定分泌抗副结核分枝ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系，其染色体数目为７８－１１０条，分别为ＩｇＭ和ＩｇＧ２。应用间接ＥＬＩＳＡ法测定细胞培养液，腹水和血清效价为１０＾－２～１０＾－７。交叉试验证明，ＭｃＡｂＯ１与受试的各株副结核分枝杆菌反应强烈，与牛分枝杆菌和草分枝杆菌有微弱特异性抗原之一。ＳＤＳ－Ｐ     

抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体制备及部分特性鉴定

以原核表达系统pGEX-6p-1-N/BL21经IPTG诱导表达的重组PEDV N-GST融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,制备单克隆抗体,用原核表达系统T12-pPROHTa/BL21经IPTG诱导表达的PEDV N蛋白做筛选抗原,通过间接ELISA进行筛选,获得两株抗PEDV N蛋白杂交瘤细胞,命名为2E3、4C6。亚类鉴定为IgG1和IgG2a型,均为к链抗体,染色体数平均为(91±7)对。用制备的单抗与pGEX-6p-1-N/BL21、T12-pPROHTa/BL21诱导表达后的菌体裂解物做Western Blot试验,在不同载体表达的N蛋白处出现明显的特异性条带;通过间接ELISA做病原检测,这两株单抗不与TGEV、PRV和PrV发生交叉反应,而与PEDV显示良好的特异性反应。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

以提纯的IBV-M病毒抗原免疫BALB/C小鼠,末次免疫后三天取脾细胞与SP_2/O细胞在50％PEG2000作用下融合,三次融合两次获得成功。经抗体检测、筛选和克隆化培养,最后获得三株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系。三株杂交癌细胞经体外连续传代培养2个多月,以及液氮冻存4个月后复苏培养,仍能稳定地分泌抗体。     

桔梗种质资源过氧化物同工酶分析

32份栽培桔梗种质过氧化物同工酶谱共显示17条不同的酶带,共呈现16个酶谱类型,其中,12个为对应种质的特征酶谱。每份种质有5～9条酶带,不同种质酶谱及活性存在一定的差异,其中,A1、B1、B2、B3等4条酶带为共有带,具有种的特异性;7条（A2、A3、A4、C2、C4、C5、D3）酶带为特异性酶带,其中白花桔梗有2条特征酶带（A2、C2）。为桔梗种质资源的收集、保存、遗传育种提供了一种新技术和方法。     

猪肺炎支原体168株特异性单抗的制备及鉴定

将猪肺炎支原体168株全菌蛋白免疫小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,3次亚克隆后,获得了4株针对168株全菌蛋白的单抗,分别将其命名为2F5、2G7、4F5、5E9。Western-blot检测结果表明,2G7、4F5与猪肺炎支原体具有特异性反应条带,不与猪鼻支原体、大肠杆菌反应。亚型鉴定结果表明,两株特异性单抗(2G7、4F5)的亚型属IgG1,轻链为κ型,2F5、5E9亚型属IgG2a,轻链为κ型。间接免疫荧光结果表明,4株单抗均与猪肺炎支原体168株有特异性荧光反应,特异性单抗的获得为猪肺炎支原体的检测及机理研究奠定基础。