早晚熟油菜的RAPD分析及特异片段的克隆

以油菜晚熟植株(RG-8)及其早熟突变株系(RG-8M)叶片为材料,利用优化的RAPD反应体系对145条10 bp的随机引物进行了筛选,其中S265扩增得到1条RG-8特异性片段.将这条差异片段回收、克隆及测序,获得686 bp的序列.序列分析结果表明,这个片段与白菜型油菜和萝卜中的部分核苷酸序列同源性较高,均达到80%以上.由这个序列推导出的氨基酸序列与拟南芥中的shikimate kinase(莽草酸激酶)具有66%的同源性.该RAPD标记可以用来作为区分早晚熟油菜的-个指标.     

黄鳝胃瘤线虫ITS及5.8SrDNA的克隆及序列分析

为了解渝西地区黄鳝胃瘤线虫的rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8SrDNA 序列的遗传变异情况,本研究利 用PCR扩增胃瘤线虫rDNA的片段,将目的片段克隆至pMDTM19-T Vector载体,对阳性克隆进行测序,序列用 BLAST和MEGA4.0进行相似性和种系发育分析.结果表明6株胃瘤线虫分离株扩增的序列总长存在差异(890~ 892bp),其中ITS-1序列长度为350~351bp、5.8S序列长度为102~103bp及ITS-2序列长度为343bp.渝西地 区胃瘤线虫ITS序列与不同宿主胃瘤线虫的相似性最高为98.3%,表明ITS可作为分子标记用于胃瘤线虫与其他 线虫的种间鉴定.     

番鸭呼肠孤病毒分子流行病学研究

选取1998～2009年福建省不同地区番鸭中分离到番鸭呼肠孤病毒分离株中具有代表性的10株,用RT-PCR技术扩增其S1和S4基因的功能区片段,进行序列测定.序列分析表明所扩增的S1基因的目的片段为819bp,S4基因目的片段为992 bp.参照国内外已发表的部分毒株S1和S4基因序列,构建番鸭呼肠孤病毒的遗传进化树,分析遗传进化关系.国内各分离株S1基因同源性为92.2％～96.7％,与国外89026株同源性为88.5％～92.8％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为76％～78％.国内各分离株S4基因同源性为95.2％～99.3％,与国外89026株同源性为92.3％～94.5％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为21.2％～21.5％.通过遗传进化树可以看到MDRV与同属的ARV序列形成了2个大分支,而MDRV序列分为2个小分支:一支为10株分离株和国内分离株,说明国内分离株没有明显差异;一支为国外分离株89026株,这说明国内分离株与国外毒株存在地域差异.     

3株HPI+大肠杆菌fyuA与int基因的检测及序列分析

在耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的基因中,fyuA编码鼠疫菌素受体与细菌的摄铁能力调节有关,int编码的整合酶与HPI在大肠杆菌基因组αsn-tRNA位点的整合相关.根据GenBank中已发表的HPI基因序列设计2对引物,分别用于fyuA和int的PCR扩增.将从3株仔猪腹泻源HPI+大肠杆菌(S70903株、S70925株、S70931株)中扩增的片段克隆至pGEM-Teasy载体,分别获得含有fyuA和int的重组质粒.琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明:所克隆的fyuA基因大小均为948 bp,与已发表序列的同源性为98.6%～100%.所克隆的int基因片段大小均为1 391 bp,与已发表序列的同源件为96.0%～99.6%.研究结果提示,这3株细菌的fyuA基因并没有因为HPI的转移而缺失或被修饰,并且均整合在大肠杆菌基因组口αsn-tRNA位点.     

番鸭呼肠孤病毒M(M1～M3)基因序列克隆及特性分析

参考Genbank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)中片段基因序列设计合成引物,对MDRV MW9710株中片段M基因RT-PCR扩增后,进行测序和特性分析。结果显示MW9710株M1基因全长2 283bp,与MDRV S14株同源性为99.9%,与ARV同源性小于74%。M1基因仅有1个编码框13～2 211bp,编码μA蛋白,含732个氨基酸。M2基因序列全长2 155bp,与MDRV S14株同源性为99.9%,与ARV同源性小于69%。M2基因仅有1个编码框28～2 058bp,编码外壳μB蛋白。M3基因序列全长1 997bp,而ARVM3基因全长1 996bp。M3基因仅有1个编码框25～1 683bp,编码μNS蛋白。MDRV MW9710株M3基因核苷酸序列与MDRV 89330株的同源性为87.2%,与ARV同源性小于74%。MDRV MW9710株5′末端序列不保守:M1为5′-ACUUUUU,M2为5′-UCUUUUU,M3为5′-GCUUUUU,MDRV MW9710株3′末端序列UCAUC-3′保守。     

枇杷果肉色泽深浅性状的分子标记鉴定

为了探索与枇杷果肉色泽深浅有关的分子标记及其特异片段,本研究以枇杷突变体(红沙枇杷一枝芽变结出白沙果实)为材料,对其野生型和突变型果实品质进行评价。利用ISSR、SSR和SRAP 3种分子标记及前人研究的OPH-01/1800bp标记分析该突变体野生型和突变型基因组。结果表明,突变型果实可溶性固形物和总糖较高,β-胡萝卜素极显著低于野生型。所检测的108对SSR标记和9×11对SRAP引物组合在野生型和突变型没有多态性,从95条ISSR标记中获得了2条(UBC854和UBC813)多态性条带,这2条差异片段和OPH-01/1800bp标记都是在野生型出现,在突变型缺失,大小分别为1369(TB1)、535(TB2)和1719 bp(TB3)。通过NCBI数据库tblastx比对,TB1为非特异扩增片段,TB2碱基序列与枇杷果实发育中编码依赖NAD的山梨醇脱氢酶蛋白基因、苹果或梨属编码1-氨基环丙烷-1羧酸(ACC)合成酶蛋白基因等有较高同源关系;TB3与编码梨F-box蛋白、S-核酸酶和S核糖核酸酶及苹果MdSFBB9S9-α、S9核糖核酸酶和MdSFBB9S9-β等基因同源性较高。     

PCR标记对水稻温敏雄性核不育株的鉴别

用3个与水稻温敏雄性核不育(TGMS)基因紧密连锁的PCR标记C365-1、S2-40和In Del37,对云南低海拔(260 m)早季种植的2个籼稻TGMS株系配制的杂交组合的F2和F3代分离群体中筛选出的146个单株(126个TGMS单株和20个可育株)及经多代自交获得的15个TGMS株系的基因型进行鉴别,结果表明:只有标记C365-1在来自两个群体的不育株和可育株DNA池间显示出多态性。不育株DNA池产生两个PCR片段,分别为418 bp(定名为C365-418 bp)和344 bp(定名为C365-344 bp),而可育株DNA池只产生C365-418 bp片段。经克隆测序比对,显示多态性的C365-344 bp片段与水稻第2染色体上的OJ1001_D05克隆的DNA序列相似性为84%,与TGMS基因ptgms2-1和tms5的距离约为19.1 kb;与水稻第6染色体上的OJ1001_B06.3和OJ1001_B06.4两个克隆间隔区的DNA序列的相似性为98%,与TGMS基因TMS相距约1 c M。在146个单株中,标记C365-1的基因型值与单株育性表型值间的相关系数为0.944,达极显著水平。来自15个TGMS株系的每一个株系都显示出与不育株DNA池相同的带型。以上结果说明,PCR标记C365-1可较为有效地鉴别水稻TGMS株携带的TGMS基因,该标记可作为水稻TGMS株基因型分子标记辅助选择的有效标记。     

茶尺蠖核型多角体病毒湖北分离株的分子鉴定

运用PCR技术扩增茶尺蠖核型多角体病毒安徽分离株(EcobNPV-AH)和湖北分离株(EcobNPV-HB)的同源重复序列2(hr2),并对湖北分离株的hr2进行克隆和序列测定.结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒安徽分离株hr2扩增产物为2条DNA片段,大小约1300bp和1800bp,湖北分离株的hr2扩增产物为1条DNA片段,大小约1800bp,由基因型组成判断,EcobNPV-HB是新的地区分离株,其hr2全长1761个核苷酸,GC含量21.7%,编码540个氨基酸,具有重复性回文序列,较GenBank中登录的EcobNPV-AH的hr2多362个核苷酸.     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348 bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

大白菜细胞质雄性不育特异RAPD标记的筛选

根据近等基因系分析原理,以大白菜细胞质雄性不育系CMS-2及其保持系B-2为材料.对大白菜细胞质雄性不育基因及其保持基因进行RAPD标记研究。引物S391在不育系中有特异性扩增,得到一条约700bp的特异片断;引物S425在保持系中有特异性扩增,得到一条约600bp的特异片,分别命名为S391-700bp、S425-600bp。采用Blastn进行核苷酸同源序列比较,结果发现S391-700bp存在一个开放阅读框架,这一开放阅读框架与植物叶绿体丝氨酸乙酰基转移酶DNA部分片段有很高的同源性;S425-600bp是新发现的一段DNA序列。根据测序结果设计特异引物,结果表明本研究所获得的两个标记片断都能确定其特异性。     

海南黑山羊鞭虫rDNA-ITS片段的克隆及序列分析

采用寄生线虫通用引物NC5和NC2,对海南黑山羊鞭虫rDNA的ITS序列进行PCR扩增,将扩增片段纯化后克隆至pEASY-T1载体。用PCR及酶切进行鉴定,对阳性菌落质粒DNA进行测序分析。结果表明,扩增的黑山羊鞭虫ITS片段大小为1 113 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(470 bp)、5.8S(158bp)和ITS2(392 bp)序列,ITS1和ITS2与GenBank已登录的Trichuris skrjabini(Baskakov)同源性分别达到90%和99%,与T.leporis(Froelich)同源性均为84%,而与其他科线虫同源性均较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从海南黑山羊盲肠中分离到的鞭虫ITS1和ITS2均与T.skrjabini处于同一分支。研究结果为海南黑山羊盲肠鞭虫种属的确定及进一步分子生物学研究奠定基础。     

志贺氏菌RAPD鉴定方法的建立

[目的]为志贺氏菌食源性疾病的流行病学溯源和疫情控制提供理论依据。[方法]利用5个随机引物对4种不同来源的志贺氏菌进行RAPD扩增,并对得到的扩增图谱进行聚类分析。[结果]5个随机引物中,引物S3、S5表现出较好的多态性。在引物S5的扩增图谱中,志贺氏菌属中各菌均有1条600 bp左右和1条1 000 bp左右的共同谱带,而利用该引物扩增其他属细菌,扩增谱带很少或没有。这说明引物S5对志贺氏菌属细菌是特异性的。根据引物5的聚类分析结果,可将8株志贺氏菌分成4个类群。除宋内氏志贺氏菌外,其他3种6株菌间的相似系数均为1.00,与传统的血清型分型结果完全一致。[结论]采用引物S5的RAPD反应可用于志贺氏菌的快速检测。     

大白菜胞质雄性不育线粒体基因特异分子RAPD标记及克隆

用随机引物对大白菜细胞质雄性不育系及其保持系线粒体DNA的RAPD分析,在不育系与保持系的线粒体基因组间存在明显的差异,用引物S259在不育系中扩增并克隆得到特异片断(mt)S259-600bp,序列分析表明该片断与油菜线粒体基因NADH脱氢酶第四亚基序列有部分相似性,片段与雄性不育的关系还需进一步研究.     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法。[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种。[结果]从ITS和16Sr DNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记。[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础。     

尼罗罗非鱼Dmrt1基因克隆及在不同组织中的表达

Dmrt1基因是Dmrt基因家族的一个重要成员,在动物性别决定过程中发挥重要作用。参照小鼠Dmrt1基因DM保守区及有关文献,设计了1对简并引物．扩增了尼罗罗非鱼的Dmrt1基因．并对扩增产物进行了亚克隆与测序。结果在雌雄尼罗罗非鱼个体中各获得1个预期的基因片段．长度为140bp．序列无性别差异。序列同源性分析表明,尼罗罗非鱼Dmrt1基因DM盒区核苷酸序列与人和鼠相应基因的同源性为78％：编码的氨基酸序列与人和鼠相应基因编码序列的同源性为89％．充分显示了Dmrt1基因在进化上的高度保守性。进一步根据获得的Dmrt1序列,设计1对特异引物,采用RT—PCR技术对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究。结果发现,Dmrt1只在精巢中特异表达,在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达,提示该基因在性别分化和功能维持上可能具有重要作用。     

SCAR分子标记方法检测家蚕品种和纯度的研究

 【目的】家蚕（Bombyx mori L.）品种和纯度的鉴别，普遍依靠幼虫斑纹或茧形等形态鉴别方法，该方法易受环境影响，结果时效性和准确性差。【方法】筛选RAPD随机引物，稳定扩增出亲本品种的DNA特异性片段，转换成SCAR标记。 【结果】利用微量DNA抽提法，从家蚕主要品种苏5、苏6及其F1孵化前日卵快速提取单粒卵基因组DNA，筛选出RAPD随机引物S42，稳定扩增出苏5和苏6两个亲本品种的DNA特异性片段R5和R6，克隆和测序确认其大小分别为255bp和343bp。Blastn分析显示，R5的nt7～192与家蚕的一个非长末端逆转录转座子（AB002270.1）的nt183～368片段碱基序列有高达91%的相似性，无缺口序列。R6的nt5～340与家蚕的一个WGS（BAAB01113163.1）的nt675～337有91%的一致性，其中存在13个碱基的缺口序列。将2个亲本的RAPD标记转换成SCAR标记，分别利用合成的S42-255-2（P5-2）和S42-343-2（P6-2）SCAR标记引物，能够准确、快速地鉴别所标记的苏5和苏6及其F1蚕品种。【结论】SCAR分子标记方法能够检测家蚕品种和纯度。     

1种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物的开发

目的 开发用于草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda性别鉴定的分子标记引物。方法 依据草地贪夜蛾雌、雄虫性信息素结合蛋白(Pheromone-binding protein, PBP)基因片段序列的差异设计特异性性别鉴定引物;利用引物对经过形态学鉴定的草地贪夜蛾雌、雄样本进行PCR验证。结果 2对引物分别对对应的雌、雄虫样本均扩增出450 bp左右的特异性条带。结论 开发的分子标记引物可以快速有效地对各个时期的草地贪夜蛾进行性别鉴定,为研究草地贪夜蛾雌、雄个体差异提供一种有效工具。为制定基于性别鉴定的草地贪夜蛾的有效治理防控策略提供参考。     

一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的筛选

为了对山杨的幼苗进行早期的性别鉴定,通过寻找与杨属性别染色体相关的分子标记,试着鉴定山杨的雌雄。采用SSR结合BSA技术对96个山杨个体(雌性各48个)进行性别差异标记的筛选,发现1对引物(BPCA90)在雄基因池扩增出差异条带。利用引物BPCA90检测待测样品的微卫星标记基因型,若检测得到长度约550 bp的单一片段为雄性,未检测到长度约550 bp的单一片段为雌性,从而完成对山杨的雌雄性别的鉴别。整个鉴定过程操作简单,方法鉴别率为100%,且得到条带结果清晰、鉴定过程特异性高、重复性好、稳定性强。     

应用双重PCR技术鉴定猪胎儿性别及其细胞系建立

sry和zfy/x是与哺乳动物性别决定有关的重要基因。本试验针对猪sry基因设计了两对PCR引物,以zfy/x为内参基因,利用双重PCR技术对6只30d左右猪胎儿的性别进行鉴定。结果表明,所有的6个样品都有447bp(雄性)或445bp(雌性)的zfy或zfx序列的扩增带,而采用两对不同的引物对sry序列扩增后,有1个样品出现241bp和166bp的扩增带为雄性,其余的无特异性扩增带为雌性,然后采用胶原酶消化培养法建立已知性别的猪胎儿成纤维细胞系。该方法具有简单、快速、准确的特点,为转基因克隆动物研究中尽早转染目的基因以及培养特定性别的胎儿成纤维细胞系提供了可靠的依据。     

Diversity shifts of rumen bacteria induced by dietary forages in dairy cows and quantification of the changed bacteria using a new primer design strategy

The partial 16 S r RNA gene sequences(100 to 500 bp) were widely used to reveal rumen bacterial composition influenced by diets, while quantification of the changed uncultured bacteria was inconvenient due to difficult designing of specific primers based on short sequences. This study evaluated the effect of forage resources on rumen bacterial diversity and developed new strategy for primer design based on short sequences to quantify the changed uncultured bacteria. Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) analysis and subsequent band sequencing were used to reveal the distinct rumen bacteria composition in cows fed with two forage sources(single corn stover vs. mixed forages including alfalfa hay and corn silage). The bacterial diversity in the rumen of dairy cows fed with corn stover was lower than that with mixed forages(P0.05). The bacterium named R-UB affiliating to uncultured Succinivibrionaceae was identified, and it was abundant in the rumen of cows fed with mixed forages compared to corn stover. The full length 16 S r RNA gene sequences with identity of 97% to the R-UB 16 S r RNA gene sequence were obtained from Gen Bank and used to design specific primers to quantify uncultured bacterium R-UB. All sequences of amplicon from the new primers were of 100% identity to R-UB sequences indicating the high specificity of new primers. Quantitative PCR confirmed that abundance of R-UB in the rumen of cows fed with corn stover was lower than those fed with mixed forages(P0.01). New strategy for designing primers based on partial 16 S r RNA genes to quantify targeted uncultured bacteria was successfully developed. The rumen bacteria descending significantly in the cows fed corn stover compared to those fed mixed forages was identified as uncultured R-UB from Succinivibrionaceae.