鳗鲡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的质...     

鳗鲡疱疹病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus, AngHV）的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR（qPCR)检测方法。[方法]利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的重组质粒为模版,进行SYBR Green Ⅰ qPCR扩增,制作标准曲线,建立AngHV的qPCR检测方法,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。[结果]结果显示,qPCR的Ct值与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线的相关系数（R2）达到0.999,扩增效率为100.855%;该方法特异性好,仅特异性检测AngHV,而对鲤疱疹病毒Ⅲ型（Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3）、蛙虹彩病毒（Rana grylio virus, RGV）和鳗鲡虹彩病毒（Eel iridovirus, EIV）无扩增;该方法重复性好,组内和组间变异系数均小于2%;该方法灵敏性高于普通PCR法,最低可检测到10个病毒拷贝,而普通PCR法为1000个病毒拷贝。应用分析结果表明,感染AngHV的欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）的主要组织器官内均可检测到AngHV,并且鳃、鳍和皮肤黏液内的病毒量明显高于其他组织器官;对保存的25份疑似鳗鲡“脱黏败血综合征”病料进行检测,阳性检出率为96%,而普通PCR法的阳性检出率仅为76%。[结论]本研究建立的AngHV SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于AngHV的快速和定量检测,对鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控也具有重要意义。     

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立美洲鳗鲡腺瘤病毒（American Eel Adomavirus, AEAdoV）的检测方法,根据AEAdoV福建株的superfamily 3 helicases (S3H)序列,设计了二对引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,比较两种方法对AEAdoV-FJ检出率,并对美洲鳗鲡体内各组织的病毒含量进行了分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300bp,利用其构建了qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR的阈值循环数(cycle threshold value,CT)线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067％;采用普通PCR法和qPCR可检测的最低AEAdoV拷贝数分别为100个和10个;上述两种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒（Rana grylio virus,RGV）、鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus,AngHV）、鲤疱疹病毒（Koi herpes virus,KHV）、对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus,WSSV）、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(Japanese Eel Adomavirus,JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(Marbled Eel Adomavirus, MeAdoV)均无扩增反应;qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35 份美洲鳗鲡病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡组织的病毒含量分析结果显示心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾的病毒含量相对较低。上述结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况具有重要意义。     

福建鳗鲡产业发展形势分析

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒 (AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株 (AEAdoV-FJ)的superfamily 3 helicases (S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_t)线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R²)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒 (RGV)、鳗鲡疱疹病毒 (AngHV)、鲤疱疹病毒 (KHV)、对虾白斑综合征病毒 (WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

     

基于lolB基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原霍乱弧菌方法的建立

基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单、耗时短,是霍乱弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及流行病调查的有效方法。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列,设计一对能特异性扩增PCV2ORF2基因的引物,通过对PCR方法的优化,建立了快速的PCR检测方法用于病料中PCV2感染的检测。用本方法对猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)进行了扩增,均未有条带出现,表明该方法具有良好的特异性;敏感性试验表明,该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为1.0×10-5ng/μL;重复性试验表明,该方法具有良好的稳定性。     

(鱼师)鱼诺卡氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中(鱼师)鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测(鱼师)鱼诺卡氏菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10-6 μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性.应用建立的方法在(鱼师)鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果100％相符.既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值.结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于鱼类致病(鱼师)鱼诺卡氏菌的快速检测.     

鰤鱼诺卡氏菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于蛳鱼类致病鱼诺卡氏菌的快速检测。     

迟缓爱德华氏菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在Tm为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x 39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,三个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。实验结果表明所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量的优点,可用于迟缓爱德华氏菌病的快速检测。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法.结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101-8.3×108 copies/μ1的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=-3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992),扩增效率为98.1％,检测灵敏度下限为8.3× 10(1) copies/μ1,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性.对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍.利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平.本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考.     

基于vhhP2基因的SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌方法的建立

根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物, 建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法。构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品, 进行SYBR Green I实时定量PCR, 在Tm为60℃时, 扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰, 扩增所得标准曲线为y= –3.331x+37.48, 相关系数为0.998, 扩增效率为1, 最低可检测到7个拷贝。实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性, 对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

     

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。     

真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用

以真鲷虹彩病毒(Red-sea bream iridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Primer Express 3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR Green I实时定量PCR检测方法.将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.184 1gX+40.270,相关系数R2=0.996 9.熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃.该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性.利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析.     

蛙病毒PCR检测方法的建立与比较分析

为了进一步丰富蛙虹彩病毒检测方法,实验针对蛙病毒3型(frog virus 3,FV3)核衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守区设计一对特异性引物,并选取另外2种蛙病毒PCR检测方法进行对比实验,通过反应体系的优化、反应特异性和敏感性实验,建立了一种针对FV3的PCR检测方法。结果显示,该方法最低检测限可达1.2个拷贝数的病毒粒子,与神经坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、传染性脾肾坏死病毒、加州鲈弹状病毒等常见水产动物致病毒株无交叉反应。临床样品检测表明,该方法所获得的检测结果与另外2种方法一致,结果可靠。本研究所建立的FV3 PCR检测方法,具有简便、快速、敏感度好、特异性高、低成本等特点,可用于FV3蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调研。     

虾类行动障碍野田村病毒(MDNV)TaqMan RT-PCR检测方法的建立与应用

基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus,MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了 MDNV的TaqMan RT-PCR检测方法。优化后的反应组分:20.0 TaqMan RT-PCR反应液预混液中包含11.0μL一步法RT-PCR缓冲液、0.8μL酶混合物、0.3 μmol/L正向引物、0.3 μmol/L反向引物、0.4 μmol/L探针、1.0 μL模板和5.2 μL RNA-free H_2O;优化后的反应程序:54.5℃ 15 min,95℃ 1 min;45 个热循环扩增(95℃ 10 s,60.3℃ 30 s)。本研究所建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×10~(10)～1.4×10~1 copies/μL标准质粒浓度范围内,起始模板浓度对数值与反应循环数间呈良好的线性关系;该方法最低可检测5.5×10~1拷贝的RNA标准品或1.4×10~1拷贝的pMD18-MDNV标准质粒。分析结果还显示,该检测方法批内C_t值和批间C_t值的变异系数(CV)分别小于1.27%和1.83%,具有良好的重复性和稳定性。利用该方法对2019年采自我国部分省市的样品进行检测发现,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中MDNV的阳性检出率为23.5% (16/68)。本研究建立的MDNVTaqMan RT-PCR方法具有特异性、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖实践中MDNV的定性、定量检测与监测以及有效防控提供技术支持。     

虾类行动障碍野田村病毒(MDNV)TaqMan RT-PCR检测方法的建立与应用

基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus,MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的TaqMan RT-PCR检测方法.优化后的反应...     

病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测方法的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至10⁵倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。...     

鲁氏耶尔森菌qPCR快速检测方法的建立和应用

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是导致虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肠炎红嘴病的病原。本研究以鲁氏耶尔森菌毒力因子rup A基因为靶标设计1对特异性引物,以含有rup A基因部分序列的重组质粒为标准品构建标准曲线,优化建立检测鲁氏耶尔森菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对腹腔注射鲁氏耶尔森菌菌悬液的虹鳟肝、肾、脾、血液样品进行检测。结果显示,设计的引物具有良好的种间特异性,标准曲线线性方程为y=–3.3766x+40.012(R~2=0.9958);最低检测限为57 copy/μL,较常规PCR的灵敏度高出约100倍。应用检测结果表明,本方法可准确检测被鲁氏耶尔森菌感染的虹鳟样品。研究表明,所建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,可用于快速诊断虹鳟肠炎红嘴病早期病症及定量检测鲁氏耶尔森菌。     

检测与诊断猪圆环病毒PCR技术的建立及病毒的分离鉴定

本研究建立了检测与诊断猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究。该方法快速、敏感、特异性强,可扩增10ng的阳性质粒的DNA,可以从30μL病料组织悬液或全血中扩增检测出PCV,并且该方法可以区分PCV1和PCV-2,对其它病原微生物如PPV、PRRSV、SIV以及许多细菌不能检出。应用此方法对6省市的12个猪场的225份病料进行了检测,对阳性病料进行了病毒分离,对分离的病毒进行了电镜观察与序列测定,结果证实分离的病毒为PCV-2。     

鳗鲡血浆与肌肉中乙胺嘧啶检测方法的建立

通过萃取回收和色谱条件优化,建立了运用高效液相色谱法(HPLC)检测鳗鲡血浆和肌肉中乙胺嘧啶的方法。结果显示:在柱温30℃、检测波长236 nm、流动相乙腈、水、乙酸体积比为15∶85∶0.25和流速1.0 mL/min的色谱条件下,在设置鳗鲡血浆及肌肉中乙胺嘧啶浓度分别在0～5.0μg/mL与0～2.0μg/g范围内,相关曲线方程分别为y=766.68x+9.2511与y=853.96x+8.0956,相关系数(r)分别为0.9998和0.9999。在萃取回收中,向血浆和肌肉样品中分别加入适量无水硫酸钠,再分别用乙腈、三氯甲烷体积比为10∶1和5∶5的混合液萃取两次,回收率均达80%以上,日间、日内变异系数均低于3%,最低检测限可分别达0.005μg/mL和0.005μg/g。