小麦根腐病菌鉴定及其生物学特性测定

分离鉴定小麦根腐病菌，并对其进行生物学特性测定，结果表明，小麦根腐病菌属于半知菌亚门平脐蠕孢属麦根腐平脐蠕孢（Bipolaris sorokiniana(Sacc.)Shoemakey)。该菌生长的最适温度为30℃，最适PH值为7，最适培养基为PDA，60℃5min为致死温度。分生孢子在水滴中才能萌发，萌发的最适PH值为7，最适温度为25℃，在供试的营养液中，以土壤浸液中萌发率最高。     

转基因玉米LAMP检测体系的建立及应用

以转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11为研究材料,建立Bt11环状等温扩增快速检测技术方法.利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,针对Bt11中玉米基因组与外源基因结合处序列,设计4条特异引物,并对反应温度、时间、灵敏度、结果判断方法等参数进行初步探索.结果显示,LAMP检测方法最适反应温度及反应时间分别为65℃和60 min,其灵敏度为常规定性PCR的20倍.LAMP技术检测转基因玉米品系Bt11具有特异性高、快速、简便等优点,具有广阔的应用前景.     

LAMP检测无乳链球菌方法的建立及应用

以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作.结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当.所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测.     

三七根腐病菌尖孢镰刀菌的Real-time PCR检测方法

为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。     

水貂绿脓杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立水貂绿脓杆菌核酸快速检测方法。根据绿脓杆菌外毒素A基因240 bp片段保守序列设计一套LAMP特异性引物,对水貂绿脓杆菌基因组DNA进行LAMP扩增,通过浑浊度、SYBR Green荧光染料显色及电泳观察结果,并进行特异性和敏感性检验。结果表明：完成反应仅需要60 min(65℃),特异性强,最低检测限为1 ng/μL。该方法简单快捷、特异性强、灵敏度高,适合于基层使用,具有广泛的临床应用前景。     

环介导等温扩增技术检测含有CaMV35S的转基因玉米

DNA环介导等温扩增技术是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术.针对玉米表达载体的花椰菜花叶病毒35 S启动子(CaMV35S)的6个区域设计4种特异引物,对LAMP反应的MgSO4、dNTPs、Betaine、内引物、外引物各个成分进行了优化,此外还对LAMP和PCR两种不同方法的特异性进行了比较.建立转基因玉米花...     

两种同时提取小麦根腐离蠕孢菌DNA和RNA的方法比较

获得足够数量和高质量的RNA和DNA是进行分子生物学研究工作的基础。以小麦根腐离蠕孢菌为原料,分别采用溶菌酶法和液氮研磨法破碎真菌细胞壁提取DNA,用琼脂糖凝胶电泳、紫外吸收及聚合酶链式反应（PCR）技术进行核酸完整性和纯度检测。结果表明：两种方法在提取DNA时都同时得到了高质量的RNA;PCR检测结果表明DNA完整性比较高,两种方法得到的DNA质量相当;溶菌酶法中得到的RNA质量优于液氮法。利用溶菌酶破壁法提取小麦根腐离蠕孢菌DNA的提取体系可用于RNA的提取,为小麦根腐离蠕孢菌核酸的DNA和RNA的同时提取提供了一种简便、安全、可行的方法。     

利用Brn1基因分析嘴突脐孢种（Exserohilum rostratum）内变异研究

对形态变异特征较大的嘴突脐孢种Brn1基因核苷酸序列系统发育进行了分析。从系统发育树中可以看出，供试菌株与突脐孢属的其它菌种聚类在同一个分支上，与弯孢属和离蠕孢属的菌种明显区分开，形成了一个独立演化群。利用DNADIST程序计算遗传距离矩阵分析所有供试嘴突脐孢种菌株间的最小遗传距离值和最大遗传距离值分别为0.0078和0.0197，供试嘴突脐孢种菌株间的遗传距离值变化较大，但该种菌株间距离值小于系统树中种内最大遗传距离值0.0242。这一结果表明嘴突脐孢种内不同菌株间的变异属于种内变异。Brn1基因核苷酸序列分析可以用于嘴突脐孢种鉴定。     

甜瓜种子中黄瓜花叶病毒和小西葫芦黄花叶病毒的RT-LAMP可视化检测方法

本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。     

转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片测试方法的研制

根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构,利用Primer premier 5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物,优化PCR反应条件,对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%。在植物基因组与外源基因的连接区域,利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40mer oligo转化体特异性探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片,并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。证明所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。与PCR检测方法相比,基因芯片检测法灵敏度高、特异性强,可有效检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高检测的准确率和效率。     

基于核酸序列依赖性扩增技术的玉米转基因成分Bar的鉴定

为了开发高灵敏度、高特异性且易于普及的玉米转抗草丁膦抗性Bialaphos resistance(Bar)基因的鉴定方法,采用核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification,NASBA)技术,根据转基因成分Bar基因的mRNA序列,设计合成Bar基因的检测特异引物和探针,通过优化NASBA扩增反应程序和产物检测体系,开发不依赖核酸扩增仪的转基因成分Bar的分子检测试剂盒,短时间内对转基因成分Bar进行高灵敏度筛查。结果表明,检测特异性好且灵敏度高,其灵敏度可达6 fg,样本检测也说明试剂盒具有较高灵敏度和特异性,且适合基层部门和采样现场对Bar转基因成分的早期鉴定。     

葡萄苦腐病菌的分子检测方法

葡萄苦腐病菌(Greeneria uvicola)是我国检疫性有害生物.本研究根据G.uvicola的ITS基因序列,设计了PCR引物GUA-1和GUA-2以及实时荧光PCR引物GUA-P1和GUA-P2及荧光探针GUA-Probe-117.利用引物GUA-1和GUA-2进行PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄可产生354 bp的特异性片段;实时荧光PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄均出现强荧光信号(△Rn)增加.而葡萄上其他常见真菌样品以及健康的红提葡萄既无特异性扩增也无荧光信号增加.灵敏度测试中,普通PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.05ng/μL以上的样品,实时荧光PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.0005 ng/μL以上的样品.由此确立了G.uvicola的两种稳定可靠、灵敏的分子检测方法.     

南方、爪哇和花生根结线虫的快速灵敏的PCR鉴定方法

为了研制南方、爪哇和花生根结线虫快速灵敏的检测和鉴定方法，分别分离了4个南方根结线虫和3个爪哇根结线虫特异性的随机扩增多态性DNA(RAPD)片段。在这些RAPD标记DNA序列的基础上，设计了多对SCARPCR引物，并用源于国内外的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根结线虫群体验证其扩增特异性和灵敏度。最终确定了3对高效扩增的SCAR引物，     

玉米叶斑病菌麦根腐平脐蠕孢的生物学特性及其对杀菌剂的敏感性

麦根腐平脐蠕孢是引起玉米叶斑病的一种病原菌。明确了该病原菌在不同温度、pH及碳/氮源条件下的菌丝生长、产孢量及孢子萌发等生物学特性,并评价该病原菌对8种常用杀菌剂的敏感性。结果表明,温度为28℃时菌丝生长最快,达到73. 00 mm,并且孢子萌发率最高,为96. 91%;产孢的最佳温度为25℃,孢子量为15. 13×10~3/cm~2。在pH值7和8的培养基上菌丝生长最快,分别为65. 25,65. 13 mm,孢子萌发率分别为88. 75%,85. 00%;在pH值7的培养基上产孢量最高,为48. 44×10~3/cm~2。在以淀粉和蔗糖为碳源的培养基上菌丝生长量分别为53. 00,50. 17 mm;在以半乳糖为碳源的培养基上产孢量最高,为1. 93×10~4/cm~2,其次为淀粉培养基,产孢量为0. 42×10~4/cm~2;在以淀粉、半乳糖和蔗糖为碳源的培养基上孢子萌发率分别为76. 03%,74. 52%,72. 26%。在以硝酸钠为氮源的培养基上菌丝生长最快,为36. 44 mm;在以脯氨酸为氮源的培养基上产孢量最高,为5. 59×10~3/cm~2;在以脯氨酸和硝酸钠为氮源的培养基上孢子萌发率分别为49. 38%,45. 00%。对供试杀菌剂敏感性测定结果表明,戊唑醇和咯菌腈对菌丝生长抑制活性最高,EC_(50)均为0. 07 mg/L,咯菌腈对孢子萌发的抑制活性最高,EC_(50)为2. 80 mg/L。结果将为了解玉米麦根腐平脐蠕孢叶斑病的发生流行规律并制定有效防治措施提供理论依据。     

基于qPCR和LAMP技术的马铃薯晚疫病菌快速检测方法

马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）能侵染多种茄科植物,它引起的马铃薯晚疫病,是马铃薯生产中的第一大病害。为了开发能在田间快速检测马铃薯晚疫病病原的方法,利用P. infestans T30-4基因组测序数据的contig 1.18131,设计qPCR和LAMP引物,优化扩增条件后得到引物的特异性和灵敏度,最后通过检测田间收获薯块,比较形态学传统方法、qPCR及LAMP的差异。特异性检测结果发现,qPCR和LAMP仅在含有P. infestans DNA模板的体系有阳性扩增,在寄主和其他微生物DNA中均无扩增;在优化的条件下,qPCR和LAMP的检测下限可达1×10 ^-6ng/μL,在有寄主和其他微生物DNA存在的条件下,引物的灵敏度没有显著差异。利用两种快速方法对在大理、丽江及昆明3个地区田间收获薯块上检测发现,qPCR和LAMP方法得到的检出率差异极为不显著（P=0.420）,两种快速检测方法和形态学鉴定方法检出率差异极显著（P=0.009）。在大理、丽江及昆明3个地区的薯块中,两种分子检测方法检出率均比形态学方法高。其中,qPCR检测方法比形态学方法分别提高了12.00%、2.00%、8.70%;LAMP检测方法比形态学方法分别提高了11.30%、2.00%、8.70%。     

河西走廊玉米种子携带病原菌真菌的研究

为了明确甘肃省河西走廊玉米种子携带真菌的种群,探讨与种子病害的相关性,采取洗涤检测法和PDA平板法对河西走廊玉米制种基地随机采集的50个玉米品种进行种子携带真菌检测。结果表明,在供试品种上共分离得到10属真菌,分别为镰刀菌属(Fusarium)、根霉菌属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、凸脐蠕孢属(Exserohilum)、平脐蠕孢属(Bipolaris)、黄曲霉(Aspergillus)、枝孢属(Cladosporium)、黑孢霉属(Nigrospora)、木霉菌属(Trichoderma);种子表面附着镰刀菌分离率最高,达67.74%,其次为根霉属、青霉属、链格孢属;种子内部寄藏的真菌以镰刀菌分离率最高,达61.11%,其次是链格孢属、凸脐蠕孢属;不同玉米品种之间种子表面孢子负荷量有较大差异,42%品种的孢子负荷量超过332.67个/粒,以浚单29、郑单958最高,达600个/粒;种子内部的总体带菌率和带镰刀菌率在品种间差异显著,48%品种的带菌率超过37.60%,以浚单29、豫玉22最高,分别达63.33%、60.00%。56%品种带镰刀菌率超过12.87%,以浚单29、豫玉22最高,为36.67%;种子外部和内部带菌与田间玉米苗期病害和穗腐病关系密切。     

21种天然产物对小麦根腐病菌的抑菌活性

为探索小麦根腐病生防途径,筛选有效抑菌物质,达到农药减量的目的。以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、刺腐霉菌(Pythium spinosum)和小麦离蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)为供试材料,采用菌丝生长法测定了21种天然产物的抑菌活性。结果表明,反式细辛醚和顺式细辛醚对禾谷镰刀菌效果显著,EC₅₀值分别为69.99 mg/L和130.23 mg/L;白藜芦醇、顺式细辛醚和柠檬精油对刺腐霉菌有明显抑菌活性,EC₅₀值分别为24.4683 mg/L、71.02 mg/L和79.83 mg/L;丁香酚油和白藜芦醇对小麦根腐离蠕孢菌抑菌活性显著,EC₅₀值分别为14.06 mg/L和22.09 mg/L。因此,丁香酚、反式细辛醚、顺式细辛醚、白藜芦醇能有效抑制小麦根腐病菌的生长,在小麦根腐病生物防治方面具有很大应用潜力。     

蔬菜腐霉的研究进展

近几年来,随着蔬菜种植面积的不断扩大,蔬菜腐霉病发生日趋频繁,危害日趋严重,基于此目的,该文总结了国内外腐霉研究进展,阐述了蔬菜腐霉菌的形态特征和危害特点,主要针对蔬菜腐霉鉴定和检测方面的问题,在采用形态学观察的基础上,融入分子生物学PCR扩增技术和血清学技术,尤其是nrDNA-ITS（核糖体DNA基因内转录间隔区）区域分析技术,扩增腐霉菌ITS序列,测序并分析序列,设计专一性引物,达到快速鉴定和准确检测的目的,为防治蔬菜腐霉提供依据,与此同时,介绍国内外防治蔬菜腐霉的新技术、新方法,为今后的生产实践提供参考。     

抗纹枯病、根腐病的转SN1基因小麦的获得与鉴定

SN1是源于马铃薯的一种抗菌肽, 可以抑制多种植物病原菌的生长。小麦纹枯病(主要病原菌为禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis)和根腐病(主要病原菌为平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana)是小麦的主要土传真菌病害。本研究利用基因工程技术构建了SN1基因的单子叶植物表达载体pA25-SN1, 它受玉米泛素(ubiquitin)启动子的控制;采用基因枪法将pA25-SN1转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4 000块, 获得203株再生植株, 通过PCR检测出阳性植株55株, 转化率为1.38%。对转SN1基因小麦T₀~T₂代植株, 进行外源基因的PCR、Southern blot、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病菌与根腐病菌接种及其抗病性鉴定。结果表明, 转入的SN1基因已经整合到转基因小麦的基因组中, 能够在转基因小麦中遗传、转录与表达。SN1基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病和根腐病的抗性, 其抗病性可以遗传。     

基于ipaH基因的志贺菌LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种快速、特异、敏感的志贺菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法,试验针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid, ipaH)设计一套特异性引物,条件优化及特异性和敏感性验证后建立了该菌的LAMP检测方法,并应用于临床样本的检测。结果显示,62℃恒温扩增1 h能得到明显的扩增产物,除志贺菌标准菌株扩增结果为阳性外,沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和阴性对照均为阴性,检测限值达到120 fg/μL。利用建立的方法检测了20株疑似菌株和38份粪样样品,结果显示20株疑似菌和27份粪样样品为阳性,阳性率分别为100%和71.05%,说明建立的LAMP检测法具有良好的特异性和敏感性,在粪便等临床样本中志贺菌的检测与鉴定方面具有优势和应用前景。