外源添加乙偶姻对酿酒酵母产2,3-丁二醇及其菌株的影响

通过对菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株.本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5/W5-△pdc1/W5-△pdc5/W141四株菌株为试材,利用高效液相色谱法(HPLC)对乙偶姻产量和BDH酶活进行检测,从而挑选出最适合作为产2,3-BD...     

外源添加乙酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)产2,3-丁二醇影响初探

为验证乙酸作为信号分子的作用,本研究分别将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W141上清液(对照组)、W141-07 (△aldh6)上清液及1.5 g/L乙酸添加至对数生长期的W141发酵液中,检测2,3-BD产量、乙酰乳酸合成酶(ILV2)及2,3-丁二醇脱氢酶(BDH1)酶活。结果表明:当添加1.5 g/L乙酸时,2,3-BD产量、ILV2和BDH1酶活性均达到最高,分别为3.01±0.04 g/L、1.41±0.03 U/mg和0.12±0.002 U/mg,且较其余两组相比差异极显著(P<0.01)。同时,测定3组条件下ilv2(24 h)和bdh1(60 h)基因的表达情况时发现,添加W141-07上清液后,ilv2和bdh1基因的表达量分别下调了31.6%和25.0%;而添加1.5 g/L乙酸后,ilv2和bdh1的表达量均发生上调,分别是对照组的4.38及1.24倍。表明乙酸可作为信号分子驱动相关基因的表达,进而提高2,3-BD产量。     

高产2,3-丁二醇的潜在酿酒酵母菌株筛选

为了获得潜在高产2,3-丁二醇的酿酒酵母菌株,探究不同菌株生产2,3-丁二醇的潜力。通过对不同供试菌株进行形态观察、产物耐受性检测、关键酶活测定、乙偶姻产量以及发酵试验,筛选出一株生产2,3-丁二醇最有潜力的菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W141。结果表明,发现W141菌株生长迅速,能分别耐受13%(w/v)乙醇和0.8%(w/v)乙酸,具有较高的乙醇得率(0.593 g/g)和碳源利用率(发酵24 h葡萄糖消耗率为100%),关键酶α-ALS、BDH的酶活力较高,分别是0.046 U/mg和0.040 U/mg,2,3-丁二醇途径关键中间产物乙偶姻含量较高,可达0.246 g/L。说明该菌株在发酵工业中具有一定的改造空间和应用前景。     

外源添加乙偶姻对酿酒酵母W5/W141产2,3-丁二醇的影响

本研究旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。向酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W5/W141两株产2,3-BD菌株中添加不同浓度乙偶姻,并测定2,3-BD、乙醇和甘油产量随发酵时间的变化情况。S. cerevisiae W5最适乙偶姻添加浓度为12 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为2.54±0.03 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了17.6%和23.6%。S. cerevisiae W141最适乙偶姻添加浓度为10 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为1.71±0.02 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了57.1%和16.7%。通过对比,本课题最终选用S. cerevisiae W5作为最适菌株,为微生物发酵法生产2,3-BD提供新的资源。     

CRISPR/Cas9技术敲除酿酒酵母gpd2基因对产2,3-丁二醇的影响

旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2),探究其对2,3-丁二醇产量的影响。根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2)设计供体片段及gRNA片段,将gRNA片段与可表达Cas9蛋白的敲除载体相连,之后将重组质粒及供体DNA片段转化到S. cerevisiae W5细胞中,根据表型筛选及PCR验证获得gpd2基因缺失菌株。结果表明目的基因gpd2敲除成功,基因缺失菌株与原始菌株经发酵实验相比,甘油产量下降22.01%,乙醇产量提高24.65%,2,3-丁二醇产量下降10.60%。gpd2基因的敲除并没有提高2,3-丁二醇的产量,原因可能是逐渐积累的NADH会优先被细胞内大量的乙醇脱氢酶所氧化,作用于乙醇的产生,而不是优先作用于2,3-丁二醇的合成。本实验构建了适用于酿酒酵母的基因敲除系统,该系统对进一步探究酿酒酵母其他代谢产物与2,3-丁二醇合成之间的关系具有实际的借鉴意义。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3菌株发酵特性研究

通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3进行菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究采用摇瓶发酵法,改变发酵过程中的底物浓度、溶氧量和酸碱浓度,紫外分光光度法和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测2,3-BD合成途径中关键中间产物(丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻)含量和发酵产物浓度。结果表明:S. cerevisiae WBG3菌株生长良好,在80 g/L葡萄糖、30℃和200 r/min条件下,丙酮酸、α-乙酰乳酸和乙偶姻含量分别达到0.10±0.03 g/L、3.38±0.06 g/L和0.17±0.02 g/L,乙醇转化率最低为0.44±0.02 g/g。添加乙酸后,甘油产量和乙醇转化率分别较对照组降低了9.5%和10%,2,3-BD的最终产量为0.36±0.02 g/L。因此,S. cerevisiae WBG3具备生产2,3-BD的潜力。     

ptsG基因敲除对肺炎克雷伯氏菌CCR效应的缓解及发酵产2,3-BD的影响

旨在解决Klebsiella pneumoniae在利用混合碳源发酵生产2,3-丁二醇（2,3-butanediol,简称2,3-BD）时会产生碳分解代谢抑制(Carbon catabolite repression,CCR)效应,导致生产效率下降的问题。本研究以Cm抗性基因为标记,采用λRed同源重组技术成功构建ptsG基因缺失菌株K. pneumoniae HD79-N。此外,在利用葡萄糖与木糖混合碳源（葡萄糖:木糖=2:1）发酵的结果显示,K. pneumoniae HD79-N菌株由于敲除ptsG基因显著减弱了CCR效应,使其能够同步利用葡萄糖与木糖生产2,3-BD且最终产量达9.81±0.38 g/L。同时,K. pneumoniae HD79-N[0.23±0.01 g/(L·h)]菌株木糖利用率也比K. pneumoniae HD79[0.15±0.00 g/(L·h)]菌株提高了57.82%。本研究结果为缓解ptsG基因对K. pneumoniae菌株的CCR作用及提升2,3-BD的产量提供技术参考。     

单倍体酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因(pdc1)的敲除与鉴定

为了抑制单倍体酿酒酵母H14的副产物乙醇的合成,使得2,3-丁二醇产量的提升。利用基因工程手段构建载体pWCL-pdc1,获得两端含40 bp pdc1的同源重组片段-loxP-kanMX-loxP。利用Cre/loxP技术获得pdc1缺失菌株S. cerevisiae H14-01 (△pdc1)。并以野生型菌株S. cerevisiae H14为对照,进行摇瓶发酵试验。S. cerevisiae H14-01长势明显略低于原始菌株。在整个发酵期间,2,3-丁二醇的最高产量和转化率分别为0.373±0.016 g/L和0.005 g/g,分别较原始菌株提高了37.30%和4.66%,但原始菌株没有检测到乙偶姻和2,3-BD生成。另外S. cerevisiae H14-01的乙醇转化率降低了33.24%,但甘油产量提高了15.76%。说明了碳流流向乙醇被阻断之后,会增加2,3-丁二醇的产量,同时会使此部分碳流流向甘油。因此,并为进一步获得高产2,3-丁二醇的工程微生物群体奠定了基础。     

共培养条件下群体感应系统对乳酸菌产细菌素的研究进展

旨在为共培养促进乳酸菌产细菌素的机制研究提供理论依据。乳酸菌细菌素是一种天然的食品防腐剂,能够有效抑制食品腐败菌和食源性致病菌的生长,因此受到了食品工业的广泛关注。目前已有研究表明,共培养能够增加乳酸菌细菌素的产量,群体感应在乳酸菌共培养产细菌素的过程中也发挥了重要作用。为了阐明共培养对乳酸菌产细菌素的促进作用,对乳酸菌细菌素的分类、生物合成机制以及群体感应系统对乳酸菌共培养产生细菌素的调控机制进行了总结,解析了三种因素对乳酸菌共培养的促进机制,阐明了群体感应对共培养条件下的细菌素产生具有重要的调节作用。     

微生物效应蛋白在植物-微生物互作中作用的研究进展

微生物效应蛋白在植物与微生物的相互作用过程中发挥种间的信息交流功能,起到重要的桥梁作用。它通过抑制植物受体诱导的免疫、调控植物基因转录、酶激活或抑制等方式为微生物侵染植物提供便利。不同类型微生物效应蛋白发挥的功能不同,作用方式和分子机制也不尽相同,且研究状况存在一定的差异,本研究通过回顾近些年来微生物效应蛋白的研究结果,对其在细菌、真菌、卵菌等病原菌及有益共生菌侵染宿主过程中的作用和分子机制进行总结,为植物-微生物相互作用机制深入研究提供相关理论依据。