秦皇岛地区克氏原螯虾源嗜水气单胞菌分离及生物学特征分析

为鉴定引起克氏原螯虾死亡的病原菌及分析其生物学特征,从秦皇岛地区病死的疑似细菌感染的克氏原螯虾的肝脏和胰腺分离出1株病原菌,暂定名为ProcQHD。经细菌分离鉴定和16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为嗜水气单胞菌。通过人工感染动物试验、PCR法及K-B药敏纸片对其致病性、毒力基因、耐药基因及耐药性进行了研究。结果表明,ProcQHD株的LD₅₀为1.0×10⁵ CFU/mL,携带ser、act、exu、lip和Luxs 5种毒力基因;ProcQHD株对替米考星、头孢曲松、环丙沙星、土霉素、诺氟沙星等12种药物高度敏感且携带Tet(A)、Tet(C)、Tet(E)、qepA、gyrB、aac4、aadB、Ant-Ia、Sul-1、LAP-1、SHV 11种耐药基因。分析发现ProcQHD株的某些耐药表型与耐药基因之间有一定相关性。     

克氏原螯虾掘洞行为研究

克氏原螯虾(Procam barus clarkii)掘洞时间多在夜间,可持续掘洞6~8 h,一夜挖掘深度成虾可达40 cm,幼虾可达25 cm。成虾的洞穴深度大部分在50~80 cm之间,少部分可以达到80~150 cm;幼虾洞穴的深度在10~25 cm之间;体长1.2 cm的稚虾已经具备掘洞的能力,洞穴深度在10~20 cm之间。洞穴分为简单洞穴和复杂洞穴两种:85%的洞穴是简单的,即只有一条穴道,位于水面上、下10 cm之间;15%较复杂,即有2条以上的穴道,位于水面以上20 cm处。洞穴的密度为2.8~5.6个/m2。每个洞穴中一般有1~2只虾,但冬季也常发现一个洞中有3~5只虾。克氏原螯虾在繁殖季节掘洞强度增大,在寒冷的冬季,掘洞强度微弱。     

克氏原螯虾繁殖生物学研究

对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)繁殖生物学进行了研究。结果显示:克氏原螯虾的性成熟年龄为1年左右;雌虾最小体长为6.4 cm,最小体重为10 g;雄虾最小体长为7.1 cm,最小体重为20 g。5~9月为交配期,其中以6~8月为交配高峰期。克氏原螯虾交配后大约为30 d左右产卵。繁殖期为7~10月,高峰期为8~9月。10月底以后抱卵的虾由于水温逐步降低,一直延续到第2年春季才孵化。克氏原螯虾的繁殖行为与掘洞行为密切相关,繁殖期的掘洞数量较非繁殖期明显增多。7~10月,亲虾均栖息在洞内繁殖,洞穴深度为50~80 cm。卵巢为一次产卵类型。雌雄比例为1∶1。克氏原螯虾的个体绝对繁殖力的变动范围为172~1158粒,平均为517粒。个体相对繁殖力(F/W)的变动范围为2~41粒/g,平均为21粒。个体相对繁殖力(F/L)的变动范围为47~80粒/cm,平均为63粒。     

克氏原螯虾捕捞网目研究

由于克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生存能力强,天敌少,加之其有一定的经济价值,为了更好地捕捞克氏原螯虾种群且尽量少伤害水域中其他渔获种类,有效控制克氏原螯虾种群数量,防止形成外来物种入侵,通过基本情况调查和室内试验等方法对克氏原螯虾捕捞网目进行研究。对6,20,30,40,50,60,70 mm七种网目的地笼网进行了室内试验,经比较对克氏原螯虾的捕捞能力和鱼类释放效果,结合线性拟合曲线与克氏原螯虾体长的关系,推算出20 mm网目为春季克氏原螯虾最佳捕捞网目, 30 mm网目为秋季克氏原螯虾捕捞最佳捕捞网目。     

异育银鲫病原维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

从患病的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)肝脏中分离得1株优势菌DF-1。将菌DF-1进行人工回感试验,其患病症状同自然发病症状,证明其对鲫有致病性。该菌的形态特征、主要理化特性、16S rRNA序列测定结果及系统发育树的构建均表明其为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。药敏试验结果表明,该菌对甲哌利福霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、阿洛西林、氟苯尼考等12种药物敏感,对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、罗红霉素、克林霉素等15种药物表现出耐药性。     

克氏原螯虾细菌性病原分离鉴定及血清免疫因子变化

克氏原螯虾是当今中国人工养殖最广的淡水螯虾品种。近几年来,稻田养虾面积呈暴发式增长,但随着养殖规模的扩大,养殖环境的恶化,各种病害频发。为探明稻田养殖克氏原螯虾死亡的原因,实验取濒死病虾胃和肠组织进行病原菌分离,用生理生化实验、16S rDNA基因序列测定与系统进化分析鉴定优势菌;用回归感染和药敏实验评价优势菌毒力和药物敏感性,通过血清免疫相关酶活性变化探究优势菌的致病机理。结果显示,分离获得1株优势菌PCW-01,回归感染健康克氏原螯虾,出现与自然发病虾相同的病理症状,活力下降,胃部有积液,半致死量达0.60×10⁵ CFU/g,经理化分析和分子鉴定为维氏气单胞菌,对呋喃妥因、妥布霉素、头孢他啶等7种药物敏感。人工感染后的克氏原螯虾,体内血清谷丙转氨酶(ALT)和溶菌酶(LZM)活性极显著上升,总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著下降,丙二醛(MDA)含量略有上升。研究表明,优势菌PCW-01为致病菌,可失活抗氧化因子,破坏细胞膜结构,导致疾病发生。本研究结果揭示出了克氏原螯虾细菌性疾病的免疫应...     

春季克氏原螯虾捕捞网具研究

根据克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的生物学习性,设计了15、20、25、30、35 mm五种网目的无帽、带帽、半圆、对口四种网型的地笼网,开展了春季克氏原螯虾室外捕捞试验,探索出春季最适克氏原螯虾捕捞网具。结果表明:20 mm网目无帽型地笼网对春季克氏原螯虾的捕捞能力最好,最适宜推广。     

克氏原螯虾活体运输技术研究进展

整理了前人研究成果,重点介绍免疫增强剂、环境因子和运输方法对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)活体运输的影响并加以分析。     

克氏原螯虾酚氧化酶部分生化特性的研究

以克氏原螯虾(Procambarus clarkii)酚氧化酶(PO)为材料,采用L-DOPA为反应底物,分光光度计测定不同温度和pH条件下PO活力,研究克氏原螯虾PO的特性,为其免疫学研究及优化PO准确测定方法提供依据。结果显示PO活力最高时的温度为35℃,低于和高于35℃活力逐渐下降,45℃以上活力迅速下降;0℃仍具有最高活力的24%。在pH4.0～9.5内PO均具有活力,鳃组织最佳pH5.5,血清最佳pH6.5。因此测定克氏原螯虾PO活力的最佳参数为温度35℃,pH5.5(鳃)或6.5(血清)。以上结果说明冰浴终止反应法测定克氏原螯虾PO活力会影响结果的准确性,要慎用。     

克氏原螯虾丝氨酸蛋白酶类似物部分基因的克隆与鉴定

设计简并引物,PCR扩增了克氏原螯虾(Procam barus clarkii)丝氨酸蛋白酶类似物基因的部分序列,通过与GenBank登录的序列进行比对,结果显示该序列编码的氨基酸与其他物种的丝氨酸蛋白酶类似物氨基酸序列有较高的同源性。SMART软件分析发现其催化三联体结构中的丝氨酸被甘氨酸取代,不具备蛋白酶水解活性。     

复方中草药对克氏原螯虾生长和脱壳的影响

研究了饲料中添加复方中草药(质量分数为1%,2%和4%)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生长和脱壳的影响。结果显示,添加复方中草药后,虾的脱壳周期缩短,脱壳死亡率和非脱壳死亡率均明显降低(P<0.05),但各中草药添加组间差异不显著(P>0.05)。三个剂量的复方中草药添加组均能不同程度地提高虾的脱壳数、成功脱壳数、硬壳虾重和软壳虾重,与未添加组相比差异显著(P<0.05),其中2%组增加最为显著,分别比对照组高出71.1%、103.2%、20.3%、10.0%。回归分析表明,克氏原螯虾的特定生长率达到最大值时的中草药添加质量分数为2.74%。试验表明克氏螯虾饲料中复方中草药水平以2%左右为宜。     

冬季温度刺激对克氏原螯虾繁育的影响

通过加温刺激克氏原螯虾(Procambarus clarkii)雌虾在冬季抱卵,并对卵及幼体在不同水温下的发育过程进行观察。结果显示:经过38 d的加温刺激,在26℃下陆续观察到有虾抱卵,18℃以下未观察到抱卵虾,但该水温能促进雌虾性腺发育。雌虾经加温刺激后所抱卵在18℃,21℃和26℃下均能正常孵化出幼虾。18℃,21℃和26℃下孵化时间分别为(39.67±3.06)d,(28.33±2.52)d和(15.00±2.00)d,孵化所需时间随着温度的提升而减少(P<0.05)。孵化的幼虾经45 d养殖后,在18℃,21℃和26℃下体长分别为(1.90±0.25)cm,(2.73±0.38)cm和(3.78±0.70)cm,体重分别为(0.223±0.100)g,(0.688±0.331)g和(2.145±1.272)g。18℃,21℃水温下的幼虾在此生长阶段为非异速生长(b=3),26℃水温下的幼虾为异速生长(b>3)。在3种温度下,幼体生长速度随温度的升高明显加快(P<0.05)。     

6个克氏原螯虾群体形态学分析

为探究克氏原螯虾(Procambarus clarkii)地理群体的形态差异,采用多元统计分析方法,对长江中下游6个克氏原螯虾群体(盱眙、合肥、沅江、武汉、潜江和沙市)的10个形态学参数进行测定分析。聚类分析表明,第一分支为潜江、沅江和武汉三个群体;沙市群体和合肥群体构成第二分支,亲缘关系较近;盱眙群体与其他群体的遗传距离最远。雌、雄虾4个主成分的累积贡献率分别为84.80%和86.29%。判别分析结果显示,6个群体之间的形态参数之间差异极显著。雌体的综合判别准确率为83.52%,雄体的综合判别准确率为92.23%。结果表明,6个群体的克氏原螯虾已经产生了一定程度的形态差异,可以从形态上区分盱眙群体、合肥群体和沙市群体,其形态差异主要集中在腹宽、腹长、头胸甲长、头胸甲宽和体长。     

克氏原螯虾幼体发育时期消化酶活力及氨基酸含量研究

采用生物化学方法对克氏原螯虾各期幼体消化酶活力与氨基酸组成进行了分析。实验结果显示,在克氏原螯虾幼体发育过程中,五种消化酶活力(胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶)表现出两种变化模式:胃蛋白酶和类胰蛋白酶在幼体发育Ⅱ龄幼体期和Ⅳ龄幼体期活力较高,其中Ⅳ龄幼体期该两种酶活力最高;淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶活力为先增高后降低,在Ⅲ龄幼体期,三种酶的活力达到最高,但与Ⅳ龄幼体期的酶活力比较无显著差异。总氨基酸含量在幼体发育早期逐渐降低,幼体发育至Ⅲ龄幼体期,其氨基酸含量最低,Ⅳ龄幼体期又有所增加。在测定的所有氨基酸中谷氨酸含量最高,必需氨基酸中赖氨酸含量最高,单个必需氨基酸含量与必需氨基酸总量的比值(A/E)在整个胚胎发育过程中的变化趋于一致。     

锦鲤致病性维氏气单胞菌的分离、鉴定及药敏研究

新疆乌鲁木齐本地某养殖场锦鲤(Cyprinus carpio)突然大批死亡,在排除寄生虫感染后,怀疑是由细菌引起。为明确引起锦鲤大批死亡的致病菌,本实验对病鱼肝脏、肠道、肾脏等组织进行细菌分离纯化。通过革兰氏染色、微量生理生化反应及分子生物学鉴定,成功分离出两株菌,命名为CK5和CK9。两株菌都为革兰氏阴性短杆菌,在30℃正常生长,能利用葡萄糖、乳糖、纤维二糖,并且V-P、明胶、水杨苷实验阳性;PCR扩增其gyr B基因并测序,BLAST比对后,两株菌与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的同源性最高,分别为99.6%和99.0%,在系统发育树上与维氏气单胞菌聚为一枝。病理组织切片显示肝脏脂肪空泡变性,肾小管变性坏死。药敏实验结果表明CK5、CK9对庆大霉素、氧氟沙星、头孢噻肟、氨曲南、诺氟沙星等药物敏感,对万古霉素、克林霉素、苯唑西林耐药。     

13种稻田常用农药对克氏原螯虾幼虾的急性毒性

本研究采用室内静水法(试验用水pH 7.48,温度(25±1)℃,水体耗氧量≤1.2 mg/L)测定了13种水稻田常用药剂对质量约8～15 g的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)幼虾的急性毒性。结果显示：60 g/L二甲四氯·400 g/L灭草松、200 g/L氯虫苯甲酰胺、10%井冈霉素、50%戊唑醇·25%肟菌酯和30%吡唑醚菌酯等5种药剂在10 000 mg/L攻毒条件下试验虾72 h的存活率均为100%,稻虾田可放心使用;50%丁草胺、10%氰氟草酯、25 g/L五氟磺草胺、20%氯氟吡氧乙酸、20%烯啶虫胺·80%吡蚜酮、5%阿维菌素乳油、5%阿维菌素水分散粒剂、3%阿维菌素微乳剂等8种药剂对克氏原螯虾幼虾的24 h LC₅₀分别为1 945.36、112.85、2 884.03、141.25、5.13、39.58、275.42、358.92 mg/L;48 h LC₅₀分别为931.11、74.56、2 275.10、117.49、4.07、37.15、173.78、272.27 mg/L;72 h LC     

克氏原螫虾繁殖生物学研究

对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)繁殖生物学进行了研究.结果显示:克氏原螯虾的性成熟年龄为1年左右;雌虾最小体长为6.4 cm,最小体重为10 g;雄虾最小体长为7.1 cm,最小体重为20 g.5～9月为交配期,其中以6～8月为交配高峰期.克氏原螯虾交配后大约为30 d左右产卵.繁殖期为7～10月,高峰期为8～9月.10月底以后抱卵的虾由于水温逐步降低,一直延续到第2年春季才孵化.克氏原螯虾的繁殖行为与掘洞行为密切相关,繁殖期的掘洞数量较非繁殖期明显增多.7～10月,亲虾均柄息在洞内繁殖,洞穴深度为50～80 cm.卵巢为一次产卵类型.雌雄比例为1:1.克氏原螯虾的个体绝对繁殖力的变动范围为172～1158粒,平均为517粒.个体相对繁殖力(F/W)的变动范围为2～41粒/g,平均为21粒.个体相对繁殖力(F/L)的变动范围为47～80粒/cm,平均为63粒.     

流式细胞术在克氏原螯虾血细胞的分类、活性和免疫功能研究中的应用

应用流式细胞术(FCM)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)血细胞的分类、活性和免疫功能进行了研究。结果显示:血细胞可分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞三个亚群,组成比例分别为(26.25±5.29)%、(51.44±7.02)%和(11.20±1.82)%;螯虾血细胞的平均总凋亡率约为3.12%;血细胞对荧光大肠杆菌的吞噬活力显著(P<0.05)高于荧光微球,吞噬率分别为17.04%和14.57%;血细胞在自然生理状态下含有一定量的活性氧,其在两类颗粒细胞的含量显著(P<0.05)高于透明细胞,在大颗粒细胞中最高。结果表明,FCM能较好地应用于虾类的血细胞分类和功能研究。     

枯草芽孢杆菌对克氏原螯虾免疫机能的影响

在饲料中分别添加0、1×109、3×109和5×109cfu/kg枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),测定投喂相应饲料后第1、4、7、14、21、28天以及停止投喂枯草芽孢杆菌后的第7、14天克氏原螯虾(Procam barus clarkii)的血淋巴吞噬活性、血清溶菌活力、抗菌活力以及酚氧化酶活力。结果显示:实验组(含枯草芽孢杆菌的饲料组)的吞噬活性于投喂枯草芽孢杆菌后第7天开始显著高于对照组(P<0.05);实验组的溶菌活力、抗菌活力明显高于对照组(P<0.05),并在停药后仍维持较高水平(P<0.05);此外,酚氧化酶活力也有所增加。本研究表明,枯草芽孢杆菌对克氏原螯虾的免疫机能有促进作用。     

注射白斑综合征病毒对克氏原螯虾酚氧化酶活力的影响

将白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、大肠杆菌(Escherichia coli)(DH5α)用注射法接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii),在0~72 h之间定时检测克氏原螯虾血细胞和肝胰脏中酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活力变化。结果显示:(1)0.1 mg/m L和1 mg/m L胰蛋白酶处理样品后,样品间差异不显著。(2)加胰蛋白酶处理与未加胰蛋白酶相比,供试克氏原螯虾PO活力均升高。(3)未加胰蛋白酶与加胰蛋白酶表现出相似的特征,WSSV和Ah注射组与对照组相比均表现为,12~48 h PO活力显著高于对照组,并且在48 h达到最大值,72 h时基本恢复正常;注射DH5α组与对照组相比没有显著性变化。可见感染WSSV后,克氏原螯虾体内酚氧化酶活力发生了变化,由此推测,PO参与了螯虾体内抵御病毒的免疫反应。