山羊乳腺上皮细胞的光镜观察

采用电穿孔转化法,将EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞。细胞穿孔转化7d后在荧光显微镜下观察。结果显示,EGFP基因成功地转入体外培养的山羊乳腺上皮细胞,EGFP基因获得表达,6种电穿孔参数的转化效果基本相同。     

副猪嗜血杆菌vacJ基因缺失菌株构建及其生物学特性分析

为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株相比较,缺失vacJ后的菌株生长速率明显下降,对PK-15细胞的黏附和入侵能力则明显降低,形成生物被膜的能力也显著下降。缺失vacJ菌株对Balb/C小鼠感染模型的LD_(50)是野生株的14倍,表明vacJ基因敲除后,副猪嗜血杆菌毒力明显下降。表明vacJ基因与副猪嗜血杆菌生长、黏附入侵、生物被膜形成及毒力密切相关。     

pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）表达研究

为了研究巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）在植物体内的定殖,利用酶切连接的方法,以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因与表达载体pVLT-33为基本元件,构建了重组表达载体pVLT-EGFP,电转巴西固氮螺菌R7细胞,并利用实时荧光定量PCR (qPCR) 研究了不同温度、不同时间EGFP mRNA的表达情况。酶切及测序结果表明成功构建了pVLT-EGFP载体,并在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达;qPCR结果显示：30 ℃,诱导9 h EGFP基因的表达水平最高。本研究成功构建了重组表达载体pVLT-EGFP,为实现pVLT-EGFP的可控表达及研究固氮菌在植物体内的定殖规律及促生长机理提供了一种有效的途径。     

猪链球菌ssnA基因缺失突变菌株的构建及毒力分析

分泌型核酸酶基因ssnA是近年来研究发现的一种脱氧核糖核酸酶,被认为是一种猪链球菌2型(SS2)潜在的毒力因子。为了分析ssnA基因对于SS2毒力的影响,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组构建了SS2流行毒力株GD01的ssnA基因缺失突变菌株,并通过比较分析了野生菌株与缺失突变菌株的生长特性及溶血活性等生物学特性。结果显示,GD01株与ΔssnA突变株的生长速度及溶血活性没有明显差异;ssnA基因缺失后SS2对Hep-2细胞的黏附及入侵能力则明显下降。小鼠毒力试验结果显示,ssnA基因缺失突变菌株对于CD1小鼠LD50是6.17×108cfu,而SS2野生菌株的LD50是4.42×107cfu,缺失突变株的LD50约是野生株的14倍,表明ssnA的缺失对SS2毒力产生明显影响,提示ssnA基因在其致病过程中具有重要作用,其具体作用机制需进一步分析。     

pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的表达研究

为了研究巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)在植物体内的定殖,利用酶切连接的方法,以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因与表达载体p VLT-33为基本元件,构建了重组表达载体p VLT-EGFP,电转巴西固氮螺菌R7细胞,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)研究了不同温度、不同时间EGFP m RNA的表达情况。酶切及测序结果表明,成功构建了p VLT-EGFP载体,并在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达;q PCR结果显示:30℃,诱导9 h EGFP基因的表达水平最高。本研究成功构建了重组表达载体p VLT-EGFP,为实现p VLT-EGFP的可控表达及研究固氮菌在植物体内的定殖规律及促生长机理提供了一种有效的途径。     

湖羊myogenin重组基因表达及其亚细胞定位的研究

摘 要： [目的]构建湖羊肌细胞生成素（myogenin,MyoG）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白真核表达载体,分析EGFP-MyoG融合蛋白在NIH-3T3细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用PCR技术扩增出MyoG基因完整的CDS,克隆至真核表达载体pEGFP-C1,转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜下观察EGFP-MyoG融合蛋白的亚细胞定位,并通过RT-PCR、western blot检测蛋白的表达。[结果]酶切鉴定和DNA序列分析均证实,MyoG基因已正确插入pEGFP-C1中,获得融合蛋白表达载体pEGFP-C1-MyoG,转染NIH-3T3细胞48h后,RT-PCR检测到约680bp的特异性条带,western blot检测出相对分子量约为53kD的融合蛋白,荧光显微镜分析表明,MyoG蛋白定位于细胞核。[结论]融合蛋白EGFP-MyoG在NIH-3T3细胞中成功表达,并定位于细胞核。     

广谱拮抗菌B96-II的分子鉴定及GFP标记

用PCR方法扩增的广谱拮抗菌B96-II的16S rDNA经序列测定和BLAST同源序列比较,结合传统的形态观察、生理生化特征鉴定,确定了B96-II分类地位为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将含有绿色荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因标记的大肠杆菌一枯草芽孢杆菌穿梭表达载体(pNW33N-gfp-B96-II-N)通过原生质体法转化B96-II,获得表达GFP的4株标记菌株,在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光.室内平板抑菌试验结果表明,GFP标记对B96-II的广谱抑菌活性没有影响.     

含铁蛋白cyb5融合基因莱茵衣藻核转化表达载体的构建及转化

旨在构建并转化细胞色素cytb5基因的衣藻核转化表达载体,为其在衣藻叶绿体中对铁的利用情况研究奠定基础。将克隆的PsaD信号肽、细胞色素b5和增强型绿色荧光蛋白基因的基因融合,插入到pDBle载体中;采用玻璃珠法,将重组子导入莱茵衣藻(CW15)中;经博来霉素筛选获得转基因植株并鉴定。本项研究通过分子克隆技术获得了衣藻自身来源的PsaD信号肽、裂殖酵母来源的细胞色素b5和常用增强型绿色荧光蛋白基因片段;重组质粒pDBle-b5、pDBle-bG和pDBle-TbG测序完全正确;经博来霉素抗性筛选,获得转化衣藻单克隆;通过PCR检测转化衣藻基因组DNA,扩增片段与预期相符。实验结果表明,成功构建了pDBle-b5、pDBle-bG和pDBle-TbG衣藻核转化表达载体,重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中。     

五岳寨苏云金芽孢杆菌资源多样性分析及杀虫基因的鉴定

分离筛选高效广谱野生苏云金芽孢杆菌菌株并对五岳寨地区苏云金芽孢杆菌资源多态性进行分析。采用温度筛选法进行菌株分离筛选,光学显微镜下观测菌株的晶体形态,通过PCR-RFLP和SDS-PAGE法对这些菌株进行基因鉴定和蛋白分析,并进行生物活性测定。从土壤中分离得到72株Bt菌株,共包含13种cry基因,9种基因组合,另有8株未鉴定出基因型,SDS-PAGE蛋白分析发现这些菌株主要表达130、90、50 kDa蛋白;生物活性测定结果显示有20株对小菜蛾和棉铃虫具有高效毒力,另有4株对华北大黑鳃金龟有高效毒力,其中2株的校正死亡率可达80%。五岳寨地区苏云金芽孢杆菌资源丰富并具有良好的多态性。     

sRNA STnc1220基因缺失株对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病力的影响

为探究鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220的分子特征、生物学功能及对细菌毒力的影响,通过PCR扩增了鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220基因,分析了其分子特征,利用TargetRNA2网站预测STnc1220基因可能调控的靶基因;利用λ-Red同源重组技术构建沙门菌(STM)-基因缺失突变株,并与亲本SL1344比...     

副猪嗜血杆菌hhdB基因的鉴定和分析

为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1~H9),并对其hhdB基因进行了鉴定和分析。结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。用hhdB基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdB基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hh-dB基因之间序列同源性为97.5%~99.8%,推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素激活蛋白具有一定的相似性。RT-PCR扩增到了hhdB基因的目的条带,表明该基因在分离菌株中得到了相应的表达。这将为副猪嗜血杆菌致病菌株毒力特征基因的鉴定以及副猪嗜血杆菌致病机理的研究奠定基础。     

尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体的筛选及插入基因分析

在建立T-DNA插入突变体库的基础上,为筛选出致病力明显下降的突变体并明确其插入位点信息,对突变体的培养表型和致病性差异进行测试,研究结果为进一步阐明尖孢镰刀菌致病分子机制奠定基础。在前期构建的T-DNA插入突变体库中,采用PCR检测筛选了300株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态、生长速率、产孢量、遗传稳定性等生物学性状,用海棠胚根接种法比较突变体致病力差异,对筛选到的致病力明显减弱的突变体进行插入位点侧翼序列分析及Southern杂交分析。结果显示,283个供试突变体都已插入目的基因,并伴有绿色荧光。将T-DNA插入突变体连续转接培养5代后,在含潮霉素B的培养基上能稳定遗传,且菌落形态和颜色无明显改变;在对283株突变体进行致病性测定中,87.9%的突变菌株致病力减弱,在致病力减弱的突变体中,HS2-520、HS2-1016和HS2-2109几乎丧失了致病性。选取8株致病力明显减弱的突变体进行Southern杂交分析,结果显示,其中6株突变体为单拷贝插入菌株,1株为双拷贝插入菌株。对这8株突变体进行了TAIL-PCR侧翼序列扩增,经公司测序,与野生菌株HS2基因组序列比对后获...     

副猪嗜血杆菌不同分离株CDT基因序列测定及其遗传变异分析

CDT毒素是多种革兰氏阴性致病菌的毒力因子.为了阐明CDT毒素在副猪嗜血杆菌不同菌株中的分布及其遗传变异情况,本试验对从浙江省不同地区猪场临床发病猪中分离到的41个副猪嗜血杆菌分离株进行了CDT基因PCR扩增,并对其中21个分离株CDT 3个亚基进行了基因测序及氨基酸序列分析.结果表明:所有41个临床分离株中都可以检测...     

尼罗罗非鱼绿色荧光蛋白/GH融合表达载体的构建及其在NIH293T细胞中的表达

从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)脑垂体中分离其总RNA,经反转录合成为第一条cDNA链,再以第一条cDNA为模板,经过RT-PCR,克隆得到全长785bp的生长激素基因,序列分析表明：GH开放阅读框为615bp,共编码204个氨基酸;其中含有17个氨基酸的信号肽和187个氨基酸的成熟GH序列。同时我们将其插入到载体启动子下游,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因融合,重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序进行鉴定。通过脂质体转染分别将pEGFP-GH重组表达载体、pEGFP-N1转到293T细胞中,以检测尼罗罗非鱼GH基因表达的活性。结果显示,阳性对照组pEGFP-N1,有荧光表达的细胞占90%以上;pEGFP-GH可见绿色荧光,但是有荧光表达的细胞较少,强度较弱。上述实验现象表明,所获得的尼罗罗非鱼GH基因具有较好的表达活性,能够在真核细胞中表达。     

益绿素对沙门氏菌抑菌作用的研究

采用益绿素对从猪场猪粪中分离出的乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonlla paratyphi B)、斯坦利沙门氏菌(Salmonlla stanley)、雷根特沙门氏菌(Salmonella thunderghent)、德尔卑沙门氏菌(Salmonlla derby)以及鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)进行抑菌实验。选出对益绿素敏感性最强的1株沙门氏菌,在不同温度,不同pH值及不同质量浓度的益绿素条件下,对该株沙门氏菌的抑菌效果进行了研究。结果表明,益绿素对5株沙门氏菌均有抑菌效果,其中对雷根特沙门氏菌(Salmonella thunderghent)的抑菌效果最好,在温度为42℃,pH值为6.8～7.8,益绿素质量浓度为17.5g/L时,益绿素对该沙门氏菌的抑菌效果最佳。     

应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌4型菌株可能毒力基因

为了寻找副猪嗜血杆菌可能毒力基因,采用抑制性差减杂交技术,以HPS有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)为研究对象,构建差减杂交文库,利用Southern Blot分析和PCR鉴定进行差异基因片段的筛选。从构建的文库中共筛选得到7个特异性差异基因片段,经同源性分析,其中5个片段分别与噬菌体重组蛋白、糖基转移酶/荚膜多糖磷酸转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、核糖体蛋白丙氨酸转移酶和ABC型硝酸盐/磺酸盐/碳酸氢盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性;2个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关。利用PCR对上述可能与毒力相关的差异基因片段在9种不同血清型HPS中的分布进行了检测,结果表明,7个片段存在于多数的有毒力菌株(血清4,5,12,14,15型)中,而在无毒力菌株(血清3,11型)中均未检测到。利用SSH技术成功构建了HPS有毒力菌株SW124和无毒力菌株H465的差异表达基因差减文库,筛选获得了7个差异基因片段,且上述片段在HPS不同血清型有毒力菌株中分布广泛。     

棉花尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白的转化

棉花枯萎病是棉花的主要病害之一,严重威胁棉花产量和品质。绿色荧光蛋白(GFP)是发光水母(Aequorea victoria)体内的一种蛋白,作为报告基因拥有诸多优点,目前已被广泛应用于植物研究当中。为研究枯萎菌浸染棉花的过程及植病互作分子机理,本研究利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白(GFP)基因转入到棉花枯萎病菌中,创制转报告基因株系。结果表明:转化子连续转接2代后仍能够稳定遗传,且荧光强度良好。经荧光共聚焦显微镜观察和PCR验证GFP基因已成功转入到菌株中,转化所得的菌株将为后续可视化检测和分析枯萎病菌对棉花的侵染等研究提供帮助。     

鸡源沙门氏菌多重耐药和Ⅰ型整合子的流行调查

为了研究沙门氏菌多重耐药性与Ⅰ型整合子的流行情况,本研究从山东省鸡场分离沙门氏菌,根据Kauffmann-White方法测定其血清型,采用微量稀释法测定了沙门氏菌对19种常用抗菌药物的MIC值,并且采用PCR技术测定了Ⅰ型整合子及其携带的耐药基因盒。结果显示：本次分离得到311株沙门氏菌,包括印地安纳沙门氏菌（133株）和肠炎沙门氏菌（178株）2种血清型;药物敏感性试验表明：分离菌株对磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、萘啶酸、氨苄西林、四环素、多西环素和甲氧苄啶普遍耐药,菌株多重耐药率为91.0 %(283/311),99%的分离株对阿米卡星、多黏菌素敏感;PCR测定Ⅰ型整合子结果：Ⅰ型整合子的检出率为65.0%(202/311),其中多重耐药表型菌株Ⅰ型整合子阳性率为92.6%,202株整合子阳性菌株中有6株的携带基因盒dfr17-aadA5。上述结果表明,Ⅰ型整合子普遍存在于沙门氏菌中,并且与沙门氏菌的多重耐药性密切相关。     

逆转录病毒法制备转基因鸡的方法分析

随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡已逐渐成为生物领域研究的热点之一。为建立和优化逆转录病毒法制备转基因鸡技术平台,以pHIT-Myc3为载体,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为标记基因,采用共转染法包装泛嗜性VSV-G假逆转录病毒,浓缩后分别体外侵染鸡胚胎成肌细胞和体内胚盘下腔接种新生种蛋并孵化出雏。分别抽提成肌细胞、孵化5d的全胚和新生雏鸡不同脏器的基因组DNA进行PCR鉴定分析,结果分别在细胞和5d全胚胎及新生雏鸡的胸腺和皮肤中检测到了标记基因EGFP的存在,表明逆转录病毒法成功制备出转基因鸡,同时转基因鸡技术平台中的方法技术条件也得到了有效优化,为转基因鸡的进一步研究提供参考     

T-DNA插入产生的水稻多分蘖突变的遗传分析

在筛选和鉴定水稻T-DNA(含Basta抗性基因Bar)插入纯合体的过程中，观察到一个多分蘖的突变体。其分离群体中多分蘖和正常分蘖两种植株类型的分离比率为3∶1，符合1对基因的显性遗传。Basta 抗性检测、PCR分子检测及Southern杂交证实，该突变体是由单一T-DNA插入引起的，多分蘖性状与T-DNA共分离。该突变材料可用于插入座位的