应用于RPA nfo反应产物结果可视化的胶体金试纸条制备与评价

旨在利用6-羧基荧光素(6-FAM)与6-FAM单克隆抗体、生物素与链霉亲和素之间的特异性结合，制备可用于nfo酶切割探针的重组酶聚合酶(RPA)反应产物结果可视化的胶体金侧向免疫层析试纸条(GICS)。通过杂交瘤法和诱生腹水法制备了高亲和力的6-FAM单克隆抗体(亲和力常数为5.38×10⁹ L/mol),再运用高浓度NaCl破坏试验，确定了胶体金与6-FAM抗体的最佳标记pH值为8.0,最佳抗体标记量为12μg/mL,并使用模拟样本确定了最佳检测(T)线包被缓冲液为0.2 mol/L(pH值5.0)。然后使用RPA nfo反应产物作为实际样本，观察条带的深浅，最终确定在层析液为0.1 mol/L PB(pH值7.4)、T线包被1 mg/mL SA、反应液用量5μL及金标抗体用量10μL条件下，能实现试纸条最佳检测性能。自主研发的胶体金侧向免疫层析试纸条在加样5 min后能出现清晰的条带，与目前商品化试纸条的可视化判定结果一致，能替代现有的商品化试纸条，降低检测成本、缩短检测时间，对建立RPA nfo-GICS及RPA-CRISPR Cas12a-GICS检测方...     

柱状黄杆菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

为建立一种通过胶体金免疫层析技术快速检测柱状黄杆菌的方法,试验采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20 nm的胶体金颗粒,将其标记纯化的抗柱状黄杆菌单克隆抗体(McAb)制备出金标抗体结合垫。纯化的兔抗柱状黄杆菌多克隆抗体(PcAb)和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线(T)与质控线(C)上,制备出胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及稳定性进行测定。结果显示,该试纸条检测灵敏度为1×10³ CFU,检测时间为3.5 min,制备的试纸条与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均无交叉反应,且稳定性好。本研究首次成功建立了柱状黄杆菌胶体金快速检测方法,所制备的试纸条具有灵敏、特异、稳定、快速等优点,可用于柱状黄杆菌的检测。     

不同分子生物学方法在H5亚型禽流感病毒检测中的应用比较

H5亚型高致病性禽流感(H5-HPAI)是严重危害家禽养殖业和公共卫生健康的一类动物疫病,也是我国高度重视、严格防控的人兽共患病。目前常用检测H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)的分子生物学技术包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR (RT-qPCR)、反转录重组酶辅助扩增(RT-RAA)、RTRAA结合侧流层析试纸条(RT-RAA-LFD)、RT-RAA-簇状规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白结合侧流层析试纸条(RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD)等。为比较不同检测方法对H5-AIV检测的灵敏度差异,将制备的cRNA标准品进行倍比稀释,分别用RT-PCR、RT-qPCR、RT-RAA、RT-RAA-LFD、RT-RAA-CRISPR Cas13aLFD进行检测。结果显示:RT-PCR、RT-qPCR、RT-RAA、RT-RAA-LFD与RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD方法的检测灵敏度分别为10²、10^-1、10⁰、10⁰、10^-1     

乳酸乳球菌L19对乌鳢生长、免疫功能及抗氧化能力的影响

试验旨在探讨乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)L19对乌鳢生长、免疫功能及抗氧化能力的影响。将540尾初始体质量为(8.68±0.22)g的乌鳢随机分为6组,每组3重复,在基础饲料中分别添加0(对照组)、1.0×10⁶(10⁶组)、1.0×10⁷(10⁷组)、1.0×10⁸(10⁸组)、1.0×10⁹(10⁹组)CFU/g及1.0×10¹⁰(10¹⁰组)CFU/g L.lactis L19,配制成6种等氮等脂的试验饲料,进行为期8周的饲养试验。饲养试验结束后,测定乌鳢生长性能、血清免疫指标及肝脏和肠道中抗氧化酶活性。结果表明:L.lactis L19添加量分别为1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹CFU/g组和1.0×10¹⁰CFU/g组乌鳢的终末体质量(F...     

检测产单核细胞李氏杆菌溶血素的胶体金试纸条制备及初步应用

产单核细胞李氏杆菌为重要的食源性病原菌,本研究旨在建立快速、灵敏、特异的检测方法,提高检测效率和检测通量。李氏杆菌溶血素(LLO)蛋白经原核表达后, 制备单克隆抗体, 测定单克隆抗体的亚型、效价及亲和力。柠檬酸钠法研制LLO胶体金试纸条,并对试纸条的特异性、敏感性、重复性、稳定性及模拟样品进行检测,并初步应用于实际海产品的检测。结果发现,制备的LLO单克隆抗体特异性强、稳定性高、重复性佳、灵敏度较高,亲和力好,亲和力常数为4.25×10⁸ L·mol^－1。人工污染样品试验表明灵敏度与纯细菌培养物基本一致,为3.0×10⁵CFU·mL^-1。将LLO胶体金试纸条应用于500份海产品的实际检测中,产单核细胞李氏杆菌的阳性检出率为2.20% (11/500),略低于国标检测方法(GB4789.30—2010)的2.40%(12/500)和PCR检测方法的2.40%(12/500),三者之间符合率为91.67%。另外缩短检测时间至15 min,检测效率大幅度提高。本研究建立的LLO胶体金检测方法可用于产单核细胞李氏杆菌的快速检测。     

犬细小病毒单克隆抗体的制备及其在胶体金免疫层析试纸研发中的应用

为制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸,将F81细胞中分离的CPV免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立间接ELISA方法筛选分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2。3E2的亚类为IgG1型,腹水抗体效价为1.8×105,交叉试验表明,3E2可与CPV特异性结合,与其他犬常见病毒无交叉反应。用3E2单克隆抗体制备的检测CPV的胶体金免疫层析试纸条特异性良好,为诊断和研究CPV奠定了基础。     

鸭疫里氏杆菌二价灭活疫苗制备及免疫效力研究

【目的】根据鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)血清1型、2型贵州流行株制备二价灭活疫苗,为鸭疫里氏杆菌病的防控及疫苗研制提供研究资料。【方法】以血清1型RA(RA-G06株)、血清2型RA(RA-HS01株)地方流行株为菌种,通过涂板法测定菌株生长曲线,利用改良寇氏法计算菌株对鸭的半数致死量(median lethal dose, LD₅₀),将2株菌培养至终浓度为1×10¹⁰ CFU/mL后等比例混合,以卡波姆为佐剂制备二价灭活疫苗,经疫苗质量检验后进行雏鸭免疫试验;通过检测免疫鸭血清中特异性抗体水平和攻毒保护试验评价疫苗的保护率,对攻毒试验鸭心脏、肝脏、脾脏和脑组织进行组织病理学观察。【结果】RA-G06株和RA-HS01株均在培养12 h时到达峰值,活菌数分别为2.1×10¹¹和3.3×10¹¹ CFU/mL,LD₅₀分别为1.44×10¹⁰和2.63×10⁸ CFU/mL;制备的疫苗安全性良...     

犬C-反应蛋白荧光定量免疫层析检测方法的建立与应用

试验开展了犬C-反应蛋白(C-CRP)荧光微球免疫层析定量方法的研究,旨在研制一种操作简易、灵敏度高,用于快速定量检测C-CRP荧光免疫层析试纸条。采用双抗体夹心法和荧光免疫层析技术,以羧基荧光微球标记的抗C-CRP单克隆抗体及羊抗鸡IgY为标记抗体,抗C-CRP单克隆抗体和鸡IgY分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。结果显示,所制备C-CRP检测试纸条的检测范围为0.5～250mg/L,检测限为0.5mg/L,批内和批间变异系数(CV)分别为0.68%～6.94%和0.89%～8.79%,平均回收率为98.15%～101.19%,试剂与9种干扰物质无交叉反应。加速破坏稳定性试验表明试纸条可以常温放置24个月。临床样本测试发现,其与I-CHROMA试剂盒检测结果相关性良好(R2=0.995)。综上所述,该荧光免疫层析试纸条灵敏度、特异度较高,且操作简单、快速,可用于宠物犬临床检测。     

犬C-反应蛋白荧光定量免疫层析检测方法的建立与应用

试验开展了犬C-反应蛋白(C-CRP)荧光微球免疫层析定量方法的研究,旨在研制一种操作简易、灵敏度高,用于快速定量检测C-CRP荧光免疫层析试纸条。采用双抗体夹心法和荧光免疫层析技术,以羧基荧光微球标记的抗C-CRP单克隆抗体及羊抗鸡IgY为标记抗体,抗C-CRP单克隆抗体和鸡IgY分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。结果显示,所制备C-CRP检测试纸条的检测范围为0.5～250mg/L,检测限为0.5mg/L,批内和批间变异系数(CV)分别为0.68%～6.94%和0.89%～8.79%,平均回收率为98.15%～101.19%,试剂与9种干扰物质无交叉反应。加速破坏稳定性试验表明试纸条可以常温放置24个月。临床样本测试发现,其与I-CHROMA试剂盒检测结果相关性良好(R2=0.995)。综上所述,该荧光免疫层析试纸条灵敏度、特异度较高,且操作简单、快速,可用于宠物犬临床检测。     

牛支原体NM001株单克隆抗体的制备与鉴定

为获得抗牛支原体NM001株单克隆抗体,并评价其特性,以牛支原体分离株NM001作为抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELISA方法筛选到2株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞,命名为2C5和7G3。其细胞上清的间接ELISA抗体效价分别为6.4×10³和1.2×10⁴。经亚型测定,单抗2C5和7G3均属于IgG1类,轻链均是λ型。制备腹水并对单抗进行纯化和特性鉴定,两株单抗的间接ELISA抗体效价分别为1.02×10⁵和4.09×10⁵,且两株单抗与无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、牛巴氏杆菌均无交叉反应。Western Blot结果显示,2株单抗均能特异性识别牛支原体全菌蛋白中的相应蛋白。试验表明,单抗2C5和7G3能够与牛支原体发生特异性反应,从而为牛支原体血清学检测提供一定的物质基础。     

粪肠球菌W24对乌鳢生长性能、 抗氧化能力及免疫功能的影响

试验旨在探讨粪肠球菌(Enterococcus faecalis, E. faecalis)W24对乌鳢生长、抗氧化及免疫功能的影响。将540尾初始体重为(8.91±0.02)g的乌鳢随机分为6组,每组3个重复,在基础饲料中分别添加浓度为0(对照组)、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹CFU/g及1.0×10¹⁰CFU/g的E. faecalis W24,配制成6种试验饲料,进行为期8周的饲养试验。试验结束后,测定乌鳢生长性能、肝脏和肠道抗氧化能力及血清免疫指标。在饲料中添加1.0×10⁷CFU/g和1.0×10⁸CFU/g E. faecalis W24显著提高了乌鳢的终末体重(FBW)、增重率(WG)、饲料效率(FER)、蛋白质效率(PER)及特定生长率(SGR)(P<0.05)。添加1.0×10⁷、1.0×10⁸CFU/g和1.0×10⁹     

犬细小病毒量子点免疫层析试纸条的研制

为建立一种快速灵敏检测犬细小病毒的免疫层析方法,本研究将羧基化CdSe/ZnS量子点与犬细小病毒单克隆抗体5G7共价偶联作为捕获探针,以犬细小病毒单克隆抗体8H7、羊抗鼠IgG作为检测线、质控线制备量子点免疫层析试纸条.结果显示,该试纸条灵敏度高,最低检测限为103 TCID50/mL;特异性强,与犬瘟热病毒、犬冠状病...     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

呋喃唑酮代谢物荧光纳米颗粒免疫层析法的建立

研究将荧光纳米颗粒与呋喃唑酮代谢物单克隆抗体共价耦联在一起,以竞争法作为反应模式来制备呋喃唑酮代谢物免疫层析试纸条.所制备的免疫层析试纸条仅与呋喃唑酮代谢物AOZ有交叉反应,而与非目标检测物之间无交叉反应,其灵敏性达1.0 ng/mL,可满足相关检测标准要求.并且通过肉眼观察检测线和质控线之间的亮度,还可对AOZ进行半定量检测.该试纸条可用于食品中呋喃唑酮代谢物的检测.     

全悬浮培养LMH细胞制备FAdV-4灭活疫苗的研究

通过对LMH细胞进行驯化,获得一株可全悬浮培养的LMH细胞,命名为LMH-S。此细胞可适应无血清、高密度悬浮培养,以初始细胞密度0.5×10⁶/mL～1×10⁶/mL接种,细胞密度最高达6×10⁶/mL。研究确定生物反应器悬浮培养LMH-S细胞制备FAdV-4抗原的最优参数为：接毒时细胞密度2×10⁶/mL～3×10⁶/mL、接毒量0.1MOI～1MOI、接毒后48 h～72 h收毒,所获抗原病毒含量不低于10^9.25TCID₅₀/mL。试验鸡分别免疫0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.3 mL疫苗,攻毒保护率分别为9/10、10/10、10/10、10/10,表明疫苗有效性良好。本试验成功建立了LMH全悬浮培养细胞株,确定了FAdV-4抗原的生物反应器悬浮培养工艺,验证了悬浮培养抗原的免疫原性,为高效FAdV-4灭活疫苗的研制奠定了基础。     

新城疫病毒胶体金免疫层析试纸条的制备

为了建立一种简便、快速检测新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）的方法,本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记NDV单克隆抗体6C4制备免疫检测探针。在硝酸纤维素膜上,用微定量喷头喷好1条病毒检测线（T线）和1条羊抗鼠抗体质控线（C线）,制备免疫层析检测试纸条,使用该制备好的检测试纸条可在10 min内检测出新城疫病毒。试纸条检测NDV的灵敏度比HA试验结果提高8倍,与禽流感病毒未出现交叉反应,用缓冲液对照测试,结果为阴性,在密封、干燥、低温的条件下,试纸条的灵敏性与特异性没有明显变化。本研究建立的NDV免疫层析检测法具有特异、灵敏、稳定、操作简单等特点,符合现场快速检测的要求。     

玉米赤霉烯酮荧光免疫层析快速检测方法的研究

为了建立更灵敏的玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)快速检测方法,以量子点(quantum dots, QDs)为标记材料,利用活泼酯法标记ZEN单克隆抗体制备荧光免疫探针,以ZEN-BSA为检测线,成功制备了ZEN荧光免疫层析试纸。结果表明,该试纸回归方程为y=-0.532 5x+0.937 2,IC₅₀为6.6 ng/mL,检测限为1.2 ng/mL;与玉米赤霉酮(ZAN)交叉反应率为88.2%,与其他结构类似物交叉反应率均小于10%,与常见真菌毒素黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁,AFB₁)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、T-2均无交叉反应;玉米样品加标回收率为86.4%～108.5%,变异系数小于15%;通过高效液相色谱(HPLC)法确证,本研究建立的荧光免疫层析试纸条可用于玉米中ZEN的快速筛查。     

犬轮状病毒单克隆抗体制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】研发犬轮状病毒(Canine ratavirus, CRV)免疫学诊断试剂,制备并鉴定CRV特异性单克隆抗体,建立可用于检测CRV的胶体金免疫层析法。【方法】以CRV临床分离株SL006株为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,用杂交瘤细胞法进行细胞融合,通过间接免疫荧光法(IFA)筛选可稳定分泌CRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并制备腹水,亲和层析法进行纯化获得单克隆抗体。对获得的单克隆抗体进行鉴定,经条件优化建立胶体金试纸条检测方法,对试纸条的灵敏度、特异性、重复性和应用情况进行评价。【结果】获得了4株杂交瘤细胞,分别命名为2C12、4A5、1H3、5F3,IFA效价分别为1∶6 400、1∶12 800、1∶1 600和1∶3 200;重链亚类分别为IgG2b、IgG2a、IgG1和IgG2a,轻链亚类均为kappa;制备的胶体金试纸条检测线包被单克隆抗体4A5,对照线包被羊抗鼠IgG,金标垫包被胶体金标记的单克隆抗体2C12,对CRV病毒液的检测灵敏度为10^4.2 TCID₅₀/mL,检测犬源其他病毒犬细小病毒(Canine parvo...     

猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗对仔猪免疫效果的研究

为了评价猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗(Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗)对仔猪的免疫效果,试验将12头仔猪随机分为3组,分别为Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组、重组空载体腺病毒组和PBS对照组,分别于3组仔猪的颈部肌肉注射Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗(浓度为1×10¹⁰ pfu/mL)、空载体重组腺病毒(浓度为1×10¹⁰ pfu/mL)和PBS各2.5 mL,于试验第0,21天分两次免疫。第2次免疫后第14天,麻醉后手术切除仔猪脾脏,采用密度梯度离心法提取猪脾脏淋巴细胞,利用流式细胞仪检测仔猪CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞含量。于第1次免疫前(第0天)及免疫后第7,14,21,28,35,42,49天无菌采集各组试验猪的颈静脉血,分离血清,检测每组仔猪抗猪附红细胞体特异性抗体IgG效价及IgG₁、IgG_2a和细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平,评价Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗对...     

新城疫病毒和禽流感病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的制备

为了建立一种简便、快速而且能同时检测新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)的方法,本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,分别标记NDV单克隆抗体6C4和AIV单克隆抗体制备免疫检测探针。在硝酸纤维素膜上,用微定量喷头喷好2条病毒检测线(T线)和1条羊抗鼠抗体质控线(C线),制备复合型免疫层析检测试纸条。结果在10 min内,可同时检测出两种病毒。试纸条检测NDV的灵敏度比HA试验结果提高8倍;AIV重组抗原的检测灵敏度为1.7μg/mL。两种病毒互相测试,未出现交叉反应。用缓冲液对照测试结果为阴性。在密封、干燥、低温的条件下,试纸条的灵敏性与特异性没有明显变化。说明本研究建立的NDV和AIV免疫层析检测法具有特异、灵敏、稳定、操作简单等特点,符合现场快速检测的要求。