光皮桦EST-SSRPCR反应体系的优化

为获得稳定的聚合酶链式反应（PCR）产物,采用正交设计L25（56）对光皮桦Betula luminifera表达序列标签一简单重复序列聚合酶链式反应（EST-SSR PCR）反应体系中的5个因素：DNA模板浓度,引物浓度,镁离子（Mg2＋）浓度．三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和DNA聚合酶量进行优化,每个因素设计5个水平。优化试验结果表明：光皮桦EST-SSR最佳PCR反应体系：4．0mg·L-1DNA模板,0．500μmol·L-1引物,1．250mmol·L-1Mg2＋,0．250mm01·L-1dNTPs．0．0725×16．67mkat·L-1 rTaq酶。通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。对优化出的EST—SSRPCR反应体系进行稳定性检测．结果均能获得稳定、清晰可辨的DNA谱带。图6表3参15     

光皮桦SSR分子标记体系的建立

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）-硅珠法提取光皮桦Betula luminifera嫩叶DNA,利用近缘种日本白桦B. platyphylla var. japonica和欧洲白桦B. pendula的引物,建立光皮桦简单重复序列标记（SSR）反应体系。在体系建立过程中,采用单因素法分别对影响聚合酶链式反应（PCR）反应的因素进行分析。结果表明：在20 μL反应体系中,模板DNA用量、Mg²⁺浓度、脱氧核糖核苷酸（dNTPs）浓度、引物浓度、T_aq DNA聚合酶用量分别为60 ng,1.500 mmol·L^－1,0.175 mmol·L^－1,2.500 mmol·L^－1,1.0 × 16.67 nkat时结果最好;引物退火温度比日本白桦扩增时提高1 ℃时效果佳。PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后随机挑取其中3对引物扩增的多态性片段进行克隆测序,对引物的通用性做进一步检验,序列经比对后得到的与原物种序列相似度（max ident值）均在95.0%以上。可见,近缘种日本白桦和欧洲白桦的SSR引物可以在光皮桦上应用。图7表2参17     

松毛虫mtDNA PCR反应体系优化

为了应用线粒体DNA研究松毛虫种群的遗传结构,本研究采用正交试验设计法L16(45)对影响松毛虫mtDNA PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验并对PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了单因素梯度比较优化。建立了松毛虫mtDNA PCR反应的最佳体系即在50μL体系中含模板150 ng、0.10μmol/L引物、0.4 mmol/L dNTP、1.0UTaq DNA聚合酶、2.5 mmol/LMg2+。同时通过PCR比较,确定最佳循环次数为35个循环,最佳退火温度为56℃,获得了松毛虫mtDNA PCR反应的最佳扩增程序。     

光皮桦BlFTL基因的克隆和表达模式

通过反转录-聚合酶链式反应（RT?鄄PCR）结合如cDNA末端快速克隆（RACE）技术从光皮桦Betula luminifera中克隆到1个FT类似基因,命名为BlFTL。该基因cDNA全长为924 bp（GenBank登录号:JQ951966）,包含1个525 bp的开放阅读框（116~640 bp）,编码1个含174个氨基酸的蛋白,且具有FT蛋白典型的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）结构域。与已有部分植物中FT蛋白同源比对结果显示,BlFTL与无花果Ficus carica中FcFT序列相似性最高,达到了94%。4月为光皮桦开花期,雌花中BlFTL基因的表达量最高,茎和叶片中表达量很低。比较正常开花和不开花无性系植株嫩茎和叶片在不同时间BlFTL基因的表达情况,结果表明:BlFTL在不开花无性系植株中基本不表达,而正常开花植株中,BlFTL主要在雌花序和混合芽形成的8月以后表达。图8参13     

马铃薯致病疫霉EST-SSR PCR反应体系的优化

由致病疫霉(Phytophthora infestans Montagne de Bary)引起的马铃薯晚疫病是危害马铃薯生产的最严重病害。试验以致病疫霉菌株HH06-23为模板,以Pi08N为引物,研究致病疫霉EST-SSRPCR反应体系中各主要成分和退火温度对扩增结果的影响。优化后的PCR反应体系为:25ng模板DNA,0.5mmol·L-1dNTPs,2μL10×Buffer(Mg2+Free),1.75mmol·L-1MgCl2,15pmol引物,1.2UTaqDNA聚合酶,加ddH2O至20μL;同时确定引物退火温度为63℃。PCR体系稳定性试验结果表明,优化后的致病疫霉EST-SSRPCR反应体系稳定、可靠,适合进行致病疫霉群体遗传多样性研究。     

光皮桦成花相关MADS-box基因BlMADS1的克隆与表达

MADS-box家族基因广泛分布于植物中,在花发育过程中起着重要调控作用。采用同源克隆结合c DNA末端快速扩增技术(RACE)在光皮桦Betula luminifera中克隆到1个MADS-box基因,命名为Bl MADS1。该基因可能存在2个不同的转录本Bl MADS1S和Bl MADS1L:前者为1 150 bp,编码254个氨基酸,具有MADS-box基因的典型结构,与欧洲白桦Betula pendula的同源基因相似性最高(97%);后者长1 312 bp,但仅含有690 bp的开放阅读框(ORF),编码229个氨基酸,缺失MADS-box蛋白的C端。这种缺失可能由内含子可变剪切造成。同源比对和系统进化分析表明:Bl MADS1属于AP1/SQUA亚家族的AGL79这一分支。定量聚合酶链式反应(PCR)表达分析表明:Bl MADS1基因在根、茎、叶和花器官中均有表达,但Bl MADS1S和Bl MADS1L这2个转录本表达模式存在差异。雄花序发育过程中,Bl MADS1的2个转录本的表达峰值均在萌动雄花序时期;而在雌花序发育过程中,Bl MADS1L和Bl MADS1S表达水平的峰值分别出现在初生雌花芽和萌动雌花序。图6表1参27     

胡麻EST-SSRs标记分布特征及PCR反应体系的优化

从美国NCBI数据库中下载了286 868条亚麻EST,利用SSRIT软件检索出符合要求的SSR重复序列4 310条,占整个EST数据库的1.50%。其中三核苷酸出现频率最高,占总SSR的40.09%;SSR重复类型总共235种,序列中占总SSR比例大于1%的重复类型共有21种,占SSR序列总数的68.63%。通过正交设计(L_(16))得到了胡麻EST-SSR最佳PCR反应体系:即20μL反应体系里,引物0.2μmol/L、模板DNA 50 ng、d NTP 0.10 mmol/L、Mg~(2+)1.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.50 U/μl、2μL 10×buffer,其余用dd H_2O补齐。并通过单因素优化试验,对得到的胡麻EST-SSR最佳PCR反应体系进行了验证,结果完全一致。     

光皮桦叶片再生体系的建立

【目的】建立光皮桦叶片高效再生体系,为光皮桦的良种培育及遗传转化研究提供依据。【方法】以光皮桦无菌叶片为外殖体,分别用含0.6 mg/L TDZ 的MS、WPM和1/2MS培养基进行不定芽诱导分化,筛选最佳基本培养基;向筛选出的最佳基本培养基中添加0.05 mg/L NAA及不同质量浓度（0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/L）TDZ的激素组合组成不定芽分化培养基,用于诱导不定芽分化,筛选最佳不定芽诱导分化培养基;以1/2MS培养基为基本培养基,分别附加0,0.05,0.1,0.5,1.0,2.0 mg/L的IBA或0.5,1.0,2.0,3.0 mg/L的NAA组成生根培养基,用于再生苗生根,筛选最佳生根培养基,建立光皮桦叶片再生体系。【结果】光皮桦无菌叶片诱导不定芽的最适基本培养基为MS培养基,其诱导的不定芽最多,且芽生长状况良好,颜色深绿;最适不定芽诱导分化培养基为：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5.5 g/L,在该培养基上叶片丛生芽诱导率可达到80.00%,平均不定芽数高达12.00个,且芽生长健壮,呈深绿色;最适再生苗生根培养基为：1/2MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5.5 g/L,在该培养基上再生苗的生根率达100%,平均根数为14.5个,平均根长为11 cm,根较粗壮,基部无愈伤组织,且产生了很多毛细根。【结论】建立了光皮桦无菌苗叶片的高效再生体系。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的优化

为了对影响银杏戗ngkobiloba简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应（ISSR-PCR）扩增反应体系的因素进行优化,采用[SSR-PCR扩增技术和UVP凝胶电泳成像技术对模扳DNA浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等因素进行筛选和优化筛选优化后的反应条件：Taq酶0．3μg,2μL10×Buffer（含15mmol·L^-1 MgCl2）,模板DNA40ng,dNTP0．2mmol·L^-1,引物0．5μmol·L^-1,Mg^2＋,5nmol·L^-1。PCR扩增程序：94℃变性5min,然后进行38个循环：94℃变性30S,48～53℃（根据引物而定）退火30s,72℃延伸1min;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。上述反应条件可广泛应用于银杏的遗传多样性分析、遗传育种和转基因等方面的研究。图6表1参19     

无患子SRAP-PCR反应体系的优化

建立适合无患子Sapindus mukurossi的相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应(SRAP-PCR)最佳反应体系,为研究无患子种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良等奠定基础。以南平产的无患子叶片为材料,采用单因素法对体系中的DNA模板、镁离子、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs),引物和TaqDNA聚合酶等5因素进行优化。确立了适合无患子SRAP的最佳反应体系(20μL):1×PCR缓冲液,50 ng模板DNA,2.0 mmol·L-1镁离子,0.2 mmol·L-1dNTPs,0.5×16.67 nkat(0.5 U)TaqDNA聚合酶,0.4μmol·L-1引物。利用该体系对12份无患子种源材料进行PCR扩增,获得了清晰、稳定的DNA谱带,说明优化后的体系适宜无患子地理种源的遗传多样性分析。     

光皮桦基因组DNA 提取方法比较

为从富含次生代谢物的光皮桦Betula luminifera 嫩叶中获得高质量DNA , 设计了5 种先提核再提DNA 的CTAB 法Ⅰ , CTAB 法Ⅱ , CTAB 法Ⅲ , CTAB 法Ⅳ及改进的SDS 法, 并以常规CTAB 法为对照。用不同的方法就光皮桦基因组DNA 进行了提取, 采用琼脂糖凝胶电泳检测、A260/ A280值测定、限制性内切酶处理和PCR 扩增等方法对所提的DNA 进行了比较分析。结果表明:实验设计的5 种改进方法提取的DNA 质量要比常规法的好, 但提取的效果差异较大。其中改进的CTAB 法Ⅰ是提取光皮桦基因组DNA 的最佳方法;PCR 扩增结果表明, 不同的DNA 提取方法会影响PCR 带型的变化。图3 表1 参13     

西南桦优树选择的研究

通过对西南桦Betula alnoides 分布区的调查, 实测了25 个县261 株西南桦候选优树的数量性状、质量性状及环境因子, 对候选优树9 个性状进行相关分析后选择出材积和通直度作为西南桦选优的主要性状。采用数量化回归的方法来制定优树选择的指标, 建立了各立地因子、林分类型和树龄与材积的多元数量化模型, 其复相关系数达0.920 815 。西南桦材积实测值与理论值间差值的频率分布呈正态分布, 以其差值作为西南桦优树选择的选择指标Ii , 以I 0.5 作为分级依据, 结合通直度制定出西南桦优树选择的标准为①Ⅰ级优树:通直度为Ⅰ级, 同时Ii 0.381 257 。②Ⅱ级优树:通直度为Ⅰ级或Ⅱ级, -0.381 257 Ii 0.381 257 。③一般林木(Ⅲ级木):Ii -0.381 257 。用此标准筛选出西南桦I 级优树46 株,占候选优树的17.62 %, Ⅱ级优树145 株, 占候选优树的55.56 %。图2 表2 参11     

柳杉CAPS 遗传标记反应体系的优化

建立柳杉Cryptomeria fortunei CAPS 反应优化体系是进行柳杉遗传多样性研究的前提。通过对影响柳杉CAPS 遗传标记反应体系结果主要因子的研究, 确定了最佳的柳杉CAPS 扩增反应体系:含有2.0 L 10 Buffer , 0.08 mmolL-1dNTPs , 200mgL-1铸型DNA , 1.5 mmolL-1MgCl2 , 0.1 molL-1引物和41.675 nkat Taq DNA 聚合酶的20 L 反应液。扩增程序是94℃预变性5min , 然后94 ℃变性40 s , 58 ℃退火40 s , 72 ℃延伸80 s , 共35 个循环, 然后在72 ℃延伸5 min 。PCR 产物10.0 L, 加入2.0 L 10 Buffer , 83.350 nkat 内切酶, 7.5 L 双蒸水构成20 L 酶切反应体系。图5 表1 参8     

Optimization of PCR System in EST-SSR Analysis of Phytophthora infestans

Late blight caused by the oomycete Phytophthora infestans Montagne de Bary is a devastating disease on potato production. A total of six parameters affecting the PCR system in P. infestans were investigated based on the template DNA of the isolate HH06-23 and EST-SSR primer pair Pi08N. The results showed that the optimal annealing temperature was 63℃, and the optimum PCR system of EST-SSR was 25 ng template DNA, 0.5 mmol·L-1 dNTPs, 2 μL 10×Buffer (Mg 2+ free), 1.75 mmol·L-1 MgCl 2 , 15 pmol primer, and 1.2 U Taq DNA polymerase in total 20 μL reaction system. The PCR program was initial denaturation at 94℃ for 2 min, followed by 35 cycles of 94℃ for 30 s, 63℃ for 30 s, and 72℃ for 30 s, then a final extension step was 72℃ for 7 min, and held at 4℃. In addition, using the optimal PCR system, a total of 20 isolates of P. infestans were used for testing the stability and polymorphism of the PCR amplification. The clarity and abundant polymorphism indicated that this system was stable and suitable for researching the genetic diversity of P. infestans population.     

甜槠ISSR-PCR 反应体系的正交优化

对甜槠Castanopsis eyrei 进行遗传多样性研究的过程中, 为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR 扩增结果, 利用正交设计对Mg 2+ , dNTP , 引物, Taq 酶, 牛血清蛋白(BSA )和模板DNA 等6 种因素5 个水平进行筛选和优化。确定甜槠ISSR-PCR 最适宜反应体系为:10 L 反应体中, 1 Taq 酶配套缓冲液(10 mmolL-1 Tris-HCl , pH 9.0 , 50 mmolL-1 KCl , 10 gL-1 TritonX-100), 1.7 mmolL-1 Mg 2+ , 0.25 mmolL-1 dNTP , 8.34 nkat Taq DNA 聚合酶, 1.5 gL-1牛血清白蛋白, 6 pmol 引物, 12 ng 模板DNA 。甜槠扩增时引物UBC846 的最适退火温度为56.3 ℃。图2 表1 参23     

西南桦与红椎混交造林模式评价

为了评价西南桦（Betula alnoides）与红椎（Castanopsis hystrix）混交造林模式的优劣,以单株形质指标、胸径分布、生长量、蓄积量、虫害和林下植被为指标,对25年生西南桦与红椎异龄混交林及13年生西南桦与红椎同龄混交林和相应的西南桦纯林的林分结构、生长量及健康状况进行研究。结果表明,西南桦与红椎混交造林,有利于西南桦干形塑造,提高西南桦生长量及单位面积总蓄积量,减少西南桦的感虫率及单株的虫孔密度,避免恶性杂草对林木生长的影响。