草鱼CRP基因全长cDNA的克隆及其表达分析

利用草鱼C-反应蛋白(CRP)的EST序列(CK233056)设计引物,采用快速扩增cDNA末端(SMART-RACE)的方法克隆CRP基因的5′末端,获得1个约520 bp的cDNA片段.将该片段与EST拼接,得到CRP基因全长cDNA,长度为889 bp,含有1个672 bp的开放阅读框,两侧分别有74 bp和143 bp的5′和3′非翻译区域(open reading frame, ORF),CRP基因编码224个氨基酸残基,N端含有15个氨基酸残基的信号肽.利用RT-PCR半定量法对健康及被嗜水产气单胞菌人工感染的草鱼的心脏、脑、前肠、肾脏、肝胰脏、肌肉、脾等组织CRP的mRNA表达水平进行检测,结果表明,CRP基因在7种组织中均有表达,表达水平差异不明显.在人工感染24 h后,各组织中CRP的mRNA水平平均升高5倍左右,与哺乳动物和一些鱼类在炎症反应中血清CRP水平升高一致,而人工感染48 h后,除心脏和肌肉组织中有显著降低外,其他组织没有明显变化,仍维持较高水平.     

杜仲肉桂醇脱氢酶基因全长cDNA克隆及序列分析

以杜仲(Eucommia ulmoides Olive)4、5月份新长成的杜仲幼嫩叶片为材料,在克隆一段肉桂醇脱氢酶(cin-namyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因的基础上,以杜仲cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增法(Rapid ampli-fication of cDNA Ends,RACE)克隆了5’端828 bp和3’端798 bp cDNA序列,经5’RACE产物和3’RACE产物序列拼接,获得全长为1243bp的杜仲CAD cDNA序列,开放阅读框编码243个氨基酸,命名为EuCAD(GenBank登录号:DQ142643)。与GenBank中序列比对分析发现,该cDNA序列与苹果树、桉树、红橡树中的CAD基因序列同源性均为81%,预测编码的氨基酸序列与苹果树、桉树、红橡树的同源性分别为73%、70%和70%,因此认为是杜仲肉桂醇脱氢酶基因。该基因为首次从杜仲中克隆,为探索木质素的合成调控机理奠定基础。     

草鱼胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1基因的全长cDNA克隆及表达

克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus）胰岛素样生长因子结合蛋白 1(IGFBP-1)基因的全长cDNA,并对草鱼不同时期的胚胎和成鱼不同组织进行了RT-PCR分析,以探索草鱼IGFBP-1基因的生物学功能。结果显示：(1)草鱼IGFBP-1基因cDNA全长为1 135 bp,包含一个789 bp阅读框,编码262个氨基酸残基;草鱼与鲤、斑马鱼、沟鲶、大鳞大麻哈鱼、虹鳟、五条、小鼠和人的IGFBP-1氨基酸序列相似度分别为94%、93%、69%、60%、58%、56%、40%和38%;草鱼IGFBP-1蛋白的N端和C端序列负责与胰岛素样生长因子(IGF)结合,其保守性较高。(2)RT-PCR分析结果表明,草鱼胚胎期IGFBP-1 mRNA的表达水平很低,在受精后4 hrs和8 hrs胚胎未能检测到转录本,受精12 hrs后,仅能检测到微量表达;草鱼IGFBP-1mRNA在肝脏、肾脏、肠和心脏组织中具有表达活性。鉴于IGFBP-1基因在IGF信号通路中的重要作用,又是一个低氧诱导基因,上述结果可为进一步探索IGFBP-1基因的功能奠定基础。     

黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。     

虹鳟Ndufb2基因全长cDNA序列的克隆与分析

从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的脑组织中提取RNA,经逆转录-聚合酶链反应及cDNA末端快速扩增技术克隆出Ndufb2基因全长cDNA序列(GenBank登录号:FJ534641),并对其序列进行分析.扩增结果表明:Ndufb2基因的cDNA序列全长899bp,其中5′端非翻译区长152bp,3′端非翻译区长441bp,开放阅读框长306bp,编码101个氨基酸;其N端前50个氨基酸为线粒体靶序列.将翻译的虹鳟Ndufb2蛋白序列与大西洋鲑(Salmo salar)的Ndufb2蛋白序列比对发现,其同源性高达98%,且虹鳟Ndufb2蛋白序列与已报道的哺乳动物的Ndufb2蛋白序列同源性均在55%以上.表明Ndufb2基因在进化过程中是高度保守的,推测其在线粒体呼吸链组成中发挥着重要作用.     

草鱼hepcidin基因cDNA克隆、序列分析与表达

运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplication ofcDNA Ends,RACE)技术获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hepcidin基因全长cDNA,为774 bp,包括ORF 282 bp、5’UTR 117 bp和3’UTR 383 bp,3’UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和1个mRNA不稳定基序(ATTTA)。推定编码93个氨基酸,与其它鱼类hepcidin的序列同一性为27.9%～51.6%;SignalP 4.0软件预测信号肽位于1～24位。在邻接(neighbor-joining,NJ)法构建的系统进化树中,草鱼hepcidin前体肽和其他已报导的鱼类hepcidin前体肽聚为一枝。实时定量PCR(quantitative real-time polymerasechain reaction,qPCR)检测结果显示hepcidin基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和眼等组织;柱状黄杆菌注射后4～48 h,hepcidin基因在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调。研究亮点:克隆到草鱼抗菌肽hepcidin一个新基因的全长cDNA,阐明了其所编码的hepcidin与其它脊椎动物hepcidin具有类似的结构与功能;证明其广泛分布于各组织中,参与了对细菌的免疫应答,是固有免疫的重要组成部分。     

草鱼钙网蛋白的克隆与组织表达

钙网蛋白是一种高度保守的分子伴侣蛋白,作为内质网主要的钙结合蛋白,广泛存在于真核生物细胞中,在病毒、寄生虫感染以及温度、氧气胁迫等情况下对细胞起保护作用。本试验中采用RACE方法首次克隆获得草鱼Ctenopharyngodon idellus钙网蛋白cDNA全序列,其全长为1 389 bp,开放阅读框为1 263bp,编码为421个氨基酸。将获得的草鱼钙网蛋白编码氨基酸序列与其它物种分别进行同源性比较,发现草鱼与斑马鱼Danio rerio、虹鳟Oncorhynchus mykiss的同源性较高,分别为86.26%、76.78%,而与人Homo sapiens、小家鼠Mus musculus的同源性为69.67%、69.19%。通过半定量RT-PCR检测可知,钙网蛋白在草鱼的肌肉、肠道、皮肤、肝胰脏、肾脏、脾脏、鳃和鳍中均有表达,其中在肝胰脏、鳍条中的表达量最高,除与皮肤中的表达量无显著差异外(P>0.05),均显著高于其它5个器官组织(P<0.05)。     

小金海棠类黄色条纹蛋白基因MxYSL7的克隆与表达分析

为了解铁高效基因型小金海棠抗缺铁的分子机制,对与铁运输相关的YSL基因进行了克隆与分析.分析苹果的EST库得到一个686 bp的YSL基因片段.经3′-RACE及后期拼接得到1 500 bp的该基因的3′端序列.其预测蛋白含10个跨膜区,与拟南芥AtYSL7基因同源性达71%,命名为MxYSL7.RT-PCR及Northern分析表明,小金海棠的该基因只在地上部分表达:在茎与成熟叶中,随着低铁处理时间的延长,该基因表达量减少;随着高铁处理时间的延长,该基因表达量增多.新叶中的表达趋势与茎和成熟叶中的趋势正好相反.讨论了MxYSL7在小金海棠体内铁营养代谢中的作用.认为MxYSL7可能参与了体内铁在木质部和韧皮部的运输过程,并参与铁在体内的解毒过程.     

草鱼MHCⅡα基因cDNA的克隆与组织表达分析

采用快速扩增cDNA末端方法,获得1007bp草鱼MHCⅡα基因全长eDNA片段,序列包括717bp的开放阅读框、34bp的5’端非编码区以及256bp的3’端非编码区．氨基酸序列比对和同源性比较分析结果表明,草鱼MHCⅡα与鲤鱼MHCⅡα相似性最高,为79％,与斑马鱼的相似性为75％,与人的相似性最低,为34％．RT-PCR组织表达分析,MHCⅡα基因在正常草鱼组织中除了肌肉中没有扩增出MHCⅡα基因转录本外,在所检测的其他组织中都有不同程度的表达,其中脾脏、头肾有较强的表达,血液有中等程度的表达,肝脏、眼与肌肉相对表达较弱．     

大豆铁结合蛋白基因cDNA的克隆、序列分析和表达载体的构建

根据已报道的植物铁结合蛋白基因的保守序列设计引物，用RT－PCR方法，成功地从大豆总RNA中扩增出一大小为0.771kb的cDNA片断。将该片段克隆到pUCm-T载体上，测序和序列的同源怀分析表明该片断与Proudhon等（1996）报道的大豆铁结合蛋白基因的氨基酸序列同源性达95％。利用pUCm-T和pBI121载体上共同的XbaI和SacI双酶切位点，构建了克隆片段的植物表达载体pSFKna。该载体含CaMV35S启动子、NOS终止子和NPT－Ⅱ基因，在遗传转化中可用基因枪导入受体，并通过卡那霉素抗性筛选转化子。     

鲤鱼g型溶菌酶基因的cDNA克隆及其在毕赤酵母中的表达

从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导表达72 h,获得重组体CLYG.SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示,在毕赤酵母中成功表达了重组体CLYG.     

草鱼肠道组织差异表达基因消减文库的构建

以致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染的1龄草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道组织为材料,应用抑制性差减杂交技术,构建了肠道组织的消减cDNA文库.以草鱼管家基因β-actin作为差减指标检测文库差减效率达2~(10)倍,表明感染细菌后某些差异表达基因得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到A/T载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞.     

鲤KCTD15基因的克隆和表达

通过克隆得到鲤Cyprinus carpio含钾离子通道四聚化结构域15 (KCTD15)两个基因KCTD15a和KCTD15b,其开放阅读框(Open read frame,ORF)均为774 bp,编码含257个氨基酸的多肽,编码的蛋白质相对分子量均为29 000,PI分别为7.0和6.5.经氨基酸比对和进化树分析表明:鲤KCTD15基因与斑马鱼Danio rerio、人Homo sapien、食蟹猴Macaca fascicularis、牛Bos taurus、小鼠Mus musculus、家鼠Rattus norvegicus、爪蟾Xenopus laevis等的KCTD15基因具有高度同源性,均含有一个BTB(Broad-Complex,Tramtrack and Bric a brac)模块,鱼类比哺乳动物少26个氨基酸.采用半定量RT-PCR法分析了KCTD15基因在鲤组织中的表达,结果表明:KCTD15a基因只在头肾中表达且较低,在其他组织中均不表达;KCTD15b基因在卵巢中表达最高,在鳃和皮肤中次之,在脑、肝胰脏、头肾、肠等组织中表达较低.采用实时荧光定量PCR法检测KCTD15在鲤胚胎发育时期的表达,结果表明:KCTD15a和KCTD15b基因都在受精后0h表达量最高(P＜0.05),在受精后6h和12 h均迅速下降(P＜0.05);KCTD15a基因在受精后36 h有所上升,但未达到6h的水平,在受精后72 h及破膜后3d、10 d时表达量逐渐降低;而KCTD15b基因在受精后36 h降至最低,在受精后72 h及破膜后3d时逐渐升高,但幅度不大,破膜后10 d时再次下降;KCTD15b基因的表达量总体高于KCTD15a基因的表达量.     

水稻PHD锌指蛋白cDNA的克隆及其表达分析

利用cDNA-AFLP分析籼稻明恢86应答稻纵卷叶螟取食基因差异表达,发现1个与植物同源结构域(PHD)锌指蛋白高度同源的TDF,分离获得该TDF对应的粳稻全长cDNA.该全长cDNA与籼稻、玉米、蓖麻、葡萄、拟南芥和大豆等作物PHD锌指蛋白推定氨基酸序列的同源性分别为98.43%、86.01%、54.58%57.02...     

紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶基因的克隆和结构分析

该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法从紫穗槐(Amorpha fruticosa)茎中克隆了木质素生物合成过程中重要的酶4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)的cDNA全长序列,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程.所获得的全长4CLA cDNA,有1 911个碱基,包含一个完整的阅读框架,编码540个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明4CLA 是典型的4CL蛋白,含有预计的AMP-binding 位点,接触反应区和保守的Cys.     

三角帆蚌AMP基因cDNA全序列的克隆及分子特征研究

以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)为研究材料,根据实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列,利用RACE克隆了三角帆蚌AMP基因的cDNA全序列。该cDNA序列全长为970 bp,5′端非翻译区123 bp,3′端非翻译区526 bp,开放阅读框(ORF)长为300 bp,共编码99个氨基酸,包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽,分子量为10 924.7 u。氨基酸序列分析表明,该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与海兔(Aplysia californica)theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%,而与贻贝等中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins相似度较低,推测属于抗菌肽theromacin基因家族。Jpred3软件对三角帆蚌AMP蛋白的二级结构预测结果表明,在第2~22、57~62氨基酸残基处存在α螺旋,因此,三角帆蚌的AMP蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。为进一步研究该基因的表达、功能及三角帆蚌病害防御奠定了分子基础。研究亮点:theromacin不属于常见的抗菌肽基...     

草鱼脂肪酸结合蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

    根据GenBank上已发表的其他物种的脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein, FABP)基因序列设计1对引物,从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)cDNA文库中扩增出脂肪酸结合蛋白基因,定向克隆于表达质粒载体pET32A中构建成pET32A-FABP重组体,将重组体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,以终浓度1 mmol·L-1的IPTG对其进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析表明,与阴性对照相比,阳性克隆在分子量33 kDa处有1条明显的蛋白带,大小与预期结果一致.经光密度分析可知,目的蛋白约占总可溶性蛋白的49.5%.这为进一步研究脂肪酸结合蛋白生物学特性以及FABP基因对脂肪代谢调控规律奠定了基础.     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

瓦氏黄颡鱼脂肪酸结合蛋白基因cDNA片段的克隆及分析

采用简并引物扩增得到瓦氏黄颡鱼肝型和心型脂肪酸结合蛋白cDNA片段,长度分别为335、425 bp;获得的111、114个氨基酸残基与鲤鱼(Cyprinus carpio)肝型、斜齿鳊(Rutilus rutilus)心型脂肪酸结合蛋白的氨基酸序列同源性分别达到81%和85%,表明克隆所得序列均为瓦氏黄颡鱼脂肪酸结合蛋白.定量PCR分析表明,肝脏和腹腔脂肪组织均是肝型和心型脂肪酸结合蛋白表达的主要场所.