豌豆细菌性疫病菌的分类与检测技术研究进展

由丁香假单胞菌豌豆致病变种引起的豌豆细菌性疫病可引起寄主植物花梗、花和豆荚等萎蔫枯死,导致植株猝倒,对产量影响较大.目前在世界各豌豆重要生产区广泛发生并严重危害,至今尚无有效防治措施.为防范该病菌随着豌豆进口传入我国,需要提高对该病菌的认识,研制更加快速、高效的检测方法.丁香假单胞菌豌豆致病变种与适合致病变种等9个致病变种组成基因型Ⅰ.根据丁香假单胞菌豌豆致病变种与不同豌豆品种致病性的不同,该变种又可分为8个生理小种.利用该病菌特异性片段设计的引物进行PCR扩增产物的不同,可将上述8个生理小种分为2个系统发育群.目前,对该病菌的鉴定主要通过常规的生理生化方法和环介导等温及多位点序列分析等分子生物学方法.上述检测方法存在检测周期长、检测效率低,且不能快速区分阳性结果是否来源于病原菌活细胞或死细胞等问题.可通过探索建立实时荧光PCR和数字PCR检测方法,来实现快速准确鉴定目标菌种,并对供试菌株的活性进行鉴定的目标.     

奉新县猕猴桃溃疡病病原菌鉴定

为明确江西省奉新县猕猴桃溃疡病病原菌种类。从该县7个猕猴桃生产基地采集呈典型症状的发病枝条和叶片,采用稀释分离法对其进行病菌分离并作致病性测定,共获得27个致病性细菌菌株。对各菌株进行培养性状、形态特征观察和生理生化测定,结果与文献中对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)的描述相吻合。提取各菌株基因组DNA,分别对其16S rDNA和16S-23S rDNA基因片段进行PCR扩增、测序、序列分析和构建系统发育树,结果各菌株16S rDNA和16S-23S rDNA序列长度均为1 500 bp和280 bp,且菌株间序列完全一致。将获得的两段序列利用Blast程序分别在GenBank中进行同源性搜索,发现其与丁香假单胞菌猕猴桃致病变种同源性均为100%。待鉴定菌株在系统发育树上与该变种处于同一分支。根据实验结果,将奉新县猕猴桃溃疡病的病原鉴定为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。     

PoprL启动子对丁香假单胞菌DC3000合成冠菌素的影响

冠菌素(coronatine,COR)是由多种丁香假单胞菌致病变种产生的次生代谢产物,是一种新型植物生长调节剂.为了提高菌株冠菌素产量并优化发酵培养条件,将来源于假单胞菌肽聚糖脂蛋白编码基因oprL高效表达组成型启动子PoprL,通过质粒pUCP24/recTE同源重组到丁香假单胞菌DC3000冠菌素合成基因cfl中,...     

丁香假单胞菌的分子生物学研究进展

丁香假单胞菌是好氧、腐生性强的革兰氏阴性菌,所引起的植物病害发生率位居十大细菌性植物病害之首,尤其引发的疫病在各农业大国爆发并有在世界范围扩散的趋势,给各国农业生产造成巨大的经济损失。基于国内外学者最新的分子生物学研究报道,对丁香假单胞菌的致病变种、病原菌鉴定、植物检疫、早期快速检测技术、致病机制及生物防治等方面进行综述,并探讨现阶段该病害研究存在的问题以及未来的研究方向与防治方案。     

猕猴桃溃疡病病原菌及检测方法研究进展

猕猴桃细菌性溃疡病的发生具有潜伏性、传播速度快、防治困难等特点,目前已经成为一种危害世界猕猴桃生产的毁灭性病害,其病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae,Psa）。综合国内外相关研究报道,就猕猴桃溃疡病病原菌特点、防治、传播及检测等方面进行了系统综述,旨在加深对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的认识,同时为开展该病原菌的早期检测及防治研究奠定基础。     

一种利用铁离子螯合剂恢复丁香假单胞菌菌落荧光的方法

丁香假单胞菌产生的荧光色素是一种具有毒性功能的致病性因子,也是细菌鉴定和分类的重要依据。测定了基本培养基不同组分的浓度对丁香假单胞菌荧光色素产生能力的影响,并比较了几种金属离子螯合剂对恢复丁香假单胞菌荧光物质合成能力以及细菌生长能力的影响,旨在找到恢复丁香假单胞菌在常规培养基上合成荧光色素的方法。结果如下:①丁香假单胞菌荧光色素的合成能力主要受培养基中铁离子浓度的影响,而与眎蛋白胨,以及K2HPO4、MgSO4的浓度均无关;② 0.05 g/L的螯合剂8-羟基喹啉可使丧失荧光物质合成能力的丁香假单胞菌恢复产生荧光,恢复的荧光物质合成可以被铁盐（FeCl3）逆转;但同时8-羟基喹啉对细菌生长也有一定的抑制作用;③其他金属离子螯合剂,如柠檬酸(C6H8O7·H2O)、酒石酸钠(Na2C4H4O6)、磷酸三钠(Na3PO4)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2),均不能恢复丁香假单胞菌产荧光色素。该结果表明在KB培养基中添加螯合剂8-羟基喹啉（0.05 g/L）可以使丁香假单胞菌恢复荧光物质的合成能力。     

猕猴桃细菌性溃疡病菌T3SS关键效应蛋白基因致病功能

[目的]由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是全球猕猴桃产业最具毁灭性的病害.病原细菌主要通过Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)将多种效应蛋白(T3SS effector,T3SE)注入寄主...     

猕猴桃溃疡病病菌新筛选方法与菌种鉴定

【目的】研究高效筛选猕猴桃溃疡病致病菌的新方法对湘西地区感染溃疡病的猕猴桃植株进行快速病菌分离与鉴定。【方法】以一年生猕猴桃枝条对不同糖浓度和氮浓度基质耐受情况为依据和柯赫氏法则来验证高效筛选病原菌方案的可行性与提取经筛选得到猕猴桃溃疡病病菌的DNA并扩增16Sr DNA进行系统发育树分析。【结果】本实验得到一高碳氮比(C∶N=10∶1)的筛选培养基,其对猕猴桃溃疡病致病菌筛选效率优于目前已报道的筛选基质;经筛选获得溃疡病致病菌为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种,与目前已报道的丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种亲缘关系较远,有区别于以往的文献报道。【结论】以高碳氮比(C/N)的菌种选择压力用于丁香假单胞杆菌猕猴桃致病菌的筛选是高效的。丁香假单胞杆菌猕猴桃致病菌可能出现新的变异。     

丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆表达与功能研究

采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制,并且对烟草有明显的促生作用。序列比对发现,来自丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因可分为2类,一类以hrpZPsgA1为代表,包括hrpZPsg12,另一类以hrpZPsgS1为代表,包括来自r0和Race4菌株的hrpZ基因。这2类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌harpin编码基因不存在相似性。     

鉴别丁香假单胞菌丁香致病变种和豌豆致病变种的 DNA 探针的制备

把引起豌豆枯萎病的丁香假单胞菌丁香致病变种 Pseudomonas syringae pv.syringae 菌株3319和丁香假单胞菌豌豆致病变种 P.syringae pv.pisi 的模式菌株2452的染色体 DNA 分别用限制性核酸内切酶 HindⅢ完全消化,再用 T_4DNA 连接酶把消化好的 DNA 片段连接到用HindⅢ内切酶消化的质粒载体 pUC19上,然后把重组的质粒载体转化到大肠杆菌(E.coli RR1)中去克隆.把菌株3319和2452的 DNA 用 p~(32)标记做成探针,分别与克隆菌落杂交,筛选出只对菌株3319的 DNA 有特异性的1个重组 DNA 的克隆和对菌株2452的 DNA 有特异性的2个重组 DNA 克隆.再把这3个重组质粒 DNA 分别用 P~(32)标记做成探针,与菌株3319和2452的 DNA 杂交,也显示只对各自 DNA 来源的菌株具有特异性.这3个重组质粒中,有2个携带有菌株2452的 DNA 片段,1个为0.82 kb。另1个略小于0.58 kb,还有1个质粒携带有菌株3319的 DNA 片段,为0.85 kb.     

丁香假单胞菌基因组内简单重复序列的比较分析

【目的】分析丁香假单胞菌3个致病变种基因组内简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),为病菌SSR标记开发和遗传多样性研究提供有用信息。【方法】基于公共的基因组数据库资源,对3个菌株的完全重复SSR和不完全重复SSR的丰度和组成类型等进行分析。【结果】3个菌株完全重复SSR的分布规律较为相似,其中单碱基的短重复SSR均占绝对优势,多碱基和长重复SSR则较少;菌株B728a、1448A和DC3000的不完全重复SSR总数也较相近,分别为562、529和567,其中数量最多的均为六碱基重复。但3个菌株以四、五和六碱基为基序的SSR在基序组成和数量上则表现出较高的变异性,完全重复SSR中,除AGCC、ACCTGC等基序在两个菌株中同时出现,绝大多数基序仅在单个菌株基因组内出现;不完全重复SSR中,部分基序如CCCTG、ACGCA等的出现频率在不同菌株间存在明显差异。【结论】3个菌株的不完全重复SSR在数量和结构类型上均具有较大的相似性,而菌株间的完全重复SSR在数量和组成上则存在一定差异。     

云南烟草野火病菌遗传多样性分析

应用Rep-PCR分子指纹技术结合传统植物病理学分析了51个采自云南各大烟区的烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci)以及其他不同致病变种、不同种、不同属的植物病原菌的群体遗传多样性。用REP、ERIC,BOX,IS1112和IS1113等5组专化性的引物对以上菌系基因组DNA进行PCR扩增,并对扩增指纹图谱综合进行UPGMA聚类分析,在相似水平0．92时,可将云南烟草野火病菌分为3个群,即YN1,YN2,YN3。     

桔梗叶斑病病原细菌的鉴定

2000-2001年在江苏、浙江、安徽等地发现一种桔梗病害，并从其病叶上分离得到了26个菌株。菌株接种于桔梗叶片后，发病症状与自然发病症状完全一致，并从回接病株上重新分离得到此病原菌。各菌株间致病力无明显的差异。经革兰氏染色反应、菌体形态、培养性状、生理生化反应、（G C）%等鉴定，确定该病原菌为丁香假单胞杆菌的一个新的致病变种。该病菌能引起桔梗细菌性叶斑病（又称斑点病）。     

三七细菌性叶斑病病原菌鉴定

[目的]对引起三七细菌性叶宽病的病原菌进行系统鉴定。[方法]以2011及2012年在云南文山及石林县的三七苗圃采集的三七细菌性叶斑病病株为材料,采用柯赫氏法则,检测分离菌株致病性并重新分离得到病原菌。通过病菌形态观察、致病性测定、16SrD—NA序列分析及生理生化特性分析（Biolog系统）对其进行鉴定。[结果]确定三七细菌性叶斑病病原菌为丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv．syringae）。[结论]该研究为三七细菌性叶瘫病菌详细鉴定的国内首报。     

A bacterial inhibitor of host programmed cell death defenses is an E3 ubiquitin ligase

The Pseudomonas syringae protein AvrPtoB is translocated into plant cells, where it inhibits immunity-associated programmed cell death (PCD). The structure of a C-terminal domain of AvrPtoB that is essential for anti-PCD activity reveals an unexpected homology to the U-box and RING-finger components of eukaryotic E3 ubiquitin ligases, and we show that AvrPtoB has ubiquitin ligase activity. Mutation of conserved residues involved in the binding of E2 ubiquitin-conjugating enzymes abolishes this activity in vitro, as well as anti-PCD activity in tomato leaves, which dramatically decreases virulence. These results show that Pseudomonas syringae uses a mimic of host E3 ubiquitin ligases to inactivate plant defenses.     

黄瓜非特异性脂质转移蛋白基因的序列分析及细菌性角斑病菌浸染下的表达

非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有抗菌防御功能。分析黄瓜非特异性脂质转运蛋白基因nsLTP的序列特征及其在细菌性角斑病菌浸染过程中的表达模式,对其应用于黄瓜等农作物转基因工程,增强作物抗病性具有重要意义。在黄瓜叶cDNA文库中,获得非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)cDNA序列,命名为CsnsLTP;该基因全长566 bp,编码121个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因。实时荧光定量PCR分析表明,CsnsLTP在黄瓜叶中有表达。在黄瓜细菌性角斑病菌浸染下,该基因在黄瓜叶中表达增高,并随浸染时间的延长而增强,明显受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导,推测该基因在抵御黄瓜细菌性角斑病菌浸染时具有重要作用。     

几种杀菌剂对黄瓜细菌性斑点病及大白菜软腐病的抑制作用

采用抑菌圈法和含毒介质法测定几种杀菌剂对黄瓜细菌性斑点病和大白菜软腐病的抑制作用。结果表明,抑菌效果较好的为农用链霉素、新植霉素和水合霉素;丙森锌对黄瓜细菌性斑点病较好,而对大白菜软腐病则较差;氢氧化铜、噻菌铜及中生菌素抑制作用一般;春雷霉素抑菌活性较差。     

Molecular Basis of Gene-for-Gene Specificity in Bacterial Speck Disease of Tomato

Transient expression of the Pseudomonas syringae avirulence gene avrPto in plant cells resulted in a Pto-dependent necrosis. The AvrPto avirulence protein was observed to interact directly with the Pto resistance protein in the yeast two-hybrid system. Mutations in the Pto and avrPto genes which reduce in vivo activity had parallel effects on association in the two-hybrid assay. These data suggest that during infection the pathogen delivers AvrPto into the plant host cell and that resistance is specified by direct interaction of Pto with AvrPto.     

细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌工程菌的构建及全细胞酶活性分析

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacterium sp.)的有机磷水解酶基因(opd 构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体Pymbp,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd.SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质.重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100 μmol/L Go2 培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg.用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%.重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活.