水牛精液中X和Y精子比率的鉴定

利用流式细胞仪分析水牛分离和未分离精液中精子的DNA含量,所得的直方图用高斯曲线拟合,分析计算出样本中X和Y精子的比率。结果表明:未分离的水牛精液中X精子的比率为50%,与正常水牛后代性别比率没有显著差异;而水牛的分离X精液样本中X精子占93%,分离Y精液样本中Y精子占89%。实验结果显示了流式细胞仪DNA分析法鉴定水牛精液中X和Y精子比率的可靠性,而流式细胞仪分离精子程序和方法在水牛上的应用是可靠而有效的。     

水牛精子蛋白质图谱的构建及生物信息学

以水牛为研究对象,应用SDS-PAGE电泳分离和LTQ-Orbitrap高分辨率组合式质谱构建水牛精子蛋白质图谱,鉴定出了1 074个精子蛋白质。用生物信息学手段对水牛精子蛋白质进行GO分类,其中参与细胞代谢的蛋白质所占比例最大,说明了成熟精子进行着旺盛的代谢活动,为其受精等活动提供能量准备。生物信息学分析结果显示,参与翻译后修饰的蛋白质有36%,说明成熟的精子在RNA转录和翻译水平上基本处于沉默状态时,主要靠蛋白质的翻译后修饰来实现细胞的功能。本试验为水牛精子细胞增殖发育研究、提高水牛精子活力以及受精机理研究提供了新的手段和信息。     

提高水牛冷冻精液质量的主要措施

水牛冷冻精液人工授精受胎率偏低一直是困扰奶水牛业发展的瓶颈问题.由于水牛生物学和繁殖性能的特性,水牛存在精液品质不良(射精量少、精液密度、精子活力、精子耐冻性都比黄牛低),采精间隔时间长,公牛使用年限短等问题.在探讨提高水牛人工授精受胎率的诸多因素中,提高冷冻精液质量是水牛品种改良的主要技术措施.     

世界首例通过分离XY精子进行性别控制的试管水牛在广西诞生

本刊辑:2006年2月13日,广西水牛研究所的一头杂交母水牛,通过分离XY精子,进行性别控制产下了雌性水牛双犊。这在世界尚属首例。这两头性控试管水牛犊体重均为26kg,它们的出生经历了复杂、严密的科学设计:首先,用流式细胞仪分离出良种摩拉水牛精液的X精子和Y精子;然后,将X精子与本地母牛的卵母细胞进行体外受精,生产性别控制的胚胎;最后,将三枚雌性胚胎移植给一头受体母牛,经十月怀胎后产出。该项成果的关键技术是分离XY精子技术。目前,广西大学动物繁殖研究所已掌握了这一技术,分离水牛XY精子的准确率可达90%以上,这意味着水牛生公生母…     

水牛分离精子与不同来源卵母细胞体外受精的效果研究

本研究的目的是探讨水牛分离精子与不同来源(活体采卵或屠宰场卵巢采卵)卵母细胞体外受精的效果。活体采卵是选用20头空怀河流型母水牛(其中摩拉母牛12头,尼里-拉菲母水牛8头)每间隔3 d采卵1次,连续采卵5~6周,活体采集卵母细胞;屠宰场卵巢采卵是收集屠宰场水牛卵巢,用10 mL注射器连接18 G针头吸取水牛卵巢上可视的卵泡来收集卵母细胞。将收集的AB级水牛卵母细胞在相同的条件下进行体外成熟、然后用分离或未分离精子进行体外受精以及体外培养至囊胚。结果发现:活体采卵组和屠宰场收集的水牛卵母细胞组用分离精子受精分裂率和囊胚率没有差异(P>0.05);分离精子和未分离精子的体外受精分裂率和囊胚率也没有差异(P>0.05)。由此说明,水牛分离精子可以用于体外生产性控胚胎。     

性别控制试管水牛诞生

2006年2月13日，由中国农科院广西水牛研究所的一头杂交水牛，顺利产下经XY精子性别控制的雌雄水牛双犊。据介绍水牛生公生母实现性别控制，这在世界尚属首例。出生的两头水牛犊体重都是29公斤。据广西大学动物繁殖研究所所长、博士生导师卢克焕教授介绍，小水牛的出生经历了复杂、严密的科学设计，首先是用流式细胞仪分离出良种摩拉水牛精液的X精子和Y精子，然后将X精子与本地母牛的卵母细胞进行体外受精产生性别控制的胚胎，最后将3枚雌性胚胎移植给一头受体母牛，经300多天怀胎生产。     

水牛附睾不同部位精子超微结构及荧光标记差异分析

哺乳动物精子经过附睾成熟后才能获得运动及受精的能力,为解释水牛精子在附睾中的成熟过程,本研究选用性成熟期的沼泽型水牛附睾,利用乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶微小颗粒（Percoll）梯度离心纯化分别提取附睾头、体和尾部精子,应用计算机辅助精子分析系统（CASA）检测精子活力,透射电镜观察附睾不同部位精子的超微结构,对精子进行荧光标记后,利用流式细胞仪和荧光显微镜观察检测不同部位精子质膜完整率、线粒体鞘膜电位和顶体差异。结果表明,Percoll分离得到附睾头、体和尾3部位精子的纯度达95%,不同部位精子活力分别为8.35%、20.21%和65.60%;附睾不同部位精子都存在着结构完整的精子以及相同的畸形类型,附睾尾部精子线粒体鞘高膜电位比率最高,精子质膜完整率从附睾头部到尾部逐渐升高,精子顶体完整率从附睾头部到尾部逐渐升高。本研究直观地展示了水牛附睾不同部位精子特征以及差异,为研究水牛精子成熟机理提供理论依据。     

水牛精子提取物对猪卵母细胞的孤雌激活效果

为验证精子蛋白对卵母细胞的激活效果,为提高核移植胚胎的质量提供可行方法,通过比较不同裂解方法提取的水牛精子蛋白,不同浓度提取液显微注入猪卵母细胞,对水牛精子提取物的孤雌激活效果进行研究。结果表明:采用液氮反复冻融法和超声波破碎法预处理后提取的水牛精子提取物对猪体外成熟卵母细胞都有显著的孤雌激活效果。水牛精子蛋白浓度在0.53～5.52 mg/mL,注射剂量为2～4 pL时均可有效激活猪卵母细胞,综合效果以1.77 mg/mL较佳。     

猪卵母细胞与猪、水牛及食蟹猴精子的胞质内显微受精

为探讨猪精子、水牛精子及食蟹猴精子分别注入到猪卵母细胞后原核形成及早期胚胎发育情况,利用屠宰场收集的猪卵母细胞,经体外成熟44～48h后,进行胞质内显微受精(ICSI)操作。试验1:体外培养18～19h,用Ho-echst33342荧光染色,检查原核形成情况。试验2:进行体外培养,ICSI后2d检查分裂率,7d记录囊胚率。试验1结果显示:在原核形成率上,猪同种显微受精,原核形成率(50.10%)显著高于注入水牛精子(37.06%)及食蟹猴精子(37.48%),且差异显著(P0.05),注入水牛精子和食蟹猴精子间差异不显著。试验2结果显示:猪同种显微受精所得的分裂率(86.58%)和囊胚率(29.93%)与水牛精子注入(70.98%,18.48%)、食蟹猴精子注入(78.69%,16.92%)差异显著(P0.05)。结果表明,水牛精子、食蟹猴精子分别注入到猪卵母细胞后,观察到雌雄原核和精子解聚;水牛精子注入猪卵母细胞与食蟹猴精子注入猪卵母细胞,经体外培养发育到囊胚。     

水牛精液保存研究

水牛采用人工授精时受胎率低,共主要原因之一是水牛的精子生活力較弱,据Venkataswami等报导黄牛精子的平均抗力为15,177,水牛精子則仅9,025,前者平均存活时間为3.25天(1—7天),后者平均存活时間为1.00天(0—3天),抗力較好的黄牛精子存活时間較长,水牛精子抗力較差,存活时間也就較短。另一些作者也认为,水牛精子难于作体外保存。 現有的水牛精液稀释保存液主要以檸檬酸鈉,氨基乙酸,葡萄糖或牛奶作为基础。在这四种基液的基础上改变組成的含量或添加某些物质,而构成     

水牛高低活力精子的差异蛋白质鉴定和分析

本研究开展了水牛的高低活力精子差异蛋白质组分析,利用Percoll法分离水牛高、低活力精子后分别提取总蛋白质,通过双向电泳技术获得了高活力精子和低活力精子的双向电泳图谱,图像分析表明,高、低活力精子中存在差异蛋白质18个,以高活力精子为对照组,其中6个蛋白质在低活力精子中表达量下调或缺失,12个蛋白质表达量上调。使用串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)对差异蛋白质进行鉴定,成功鉴定了3种蛋白质:精子尾部结构蛋白2、α-ATP合成酶、α-琥珀酰辅酶A合成酶。这些蛋白质与精子结构形成和线粒体能量代谢有关。该研究发现了水牛高、低活力精子的蛋白质变化,为解释精子活力低下的分子机制提供的新的线索。     

应用ICSI技术生产转基因水牛胚胎的初步研究

本研究旨在探讨水牛精子完整质膜和破损质膜的方法对水牛单精子注射(ICSI)技术转基因效果的影响。水牛精子经冻融、Triton×-100、超声波3种方法破损精子质膜后与外源质粒DNA混合,采用ICSI的方法将基因转染后的精子注射到水牛体外成熟卵内,观察水牛ICSI卵激活后的发育状态和外源基因的表达效果。结果表明:精子质膜完整性实验中,冻融破损精子质膜组早期胚胎基因表达率为21.8%,显著高于活精子组的5.1%(P<0.01);冻融组与活精子组的卵裂率、囊胚发育率均无显著差异(P>0.05)。以冻融、Triton×-100、超声波3种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率(16.7%)最高,显著高于Triton×-100组(P<0.01)。同时,冻融组的早期胚胎基因表达率亦显著高于Triton×-100组和超声断尾组(60.3%vs.31.7%vs.18.2%,P<0.01)。上述结果说明,使用ICSI技术转外源基因可获得表达EGFP基因的水牛早期胚胎;冻融精子质膜破损法能有效破损精子质膜,有利于外源DNA与精子的结合,且提高转基因效率。     

水牛PHB基因克隆与表达模式

本研究克隆水牛PHB(prohibitin)基因并运用生物信息学方法对其进行分析,同时初步探索其表达模式。首先应用RT-PCR技术扩增获得水牛PHB基因片段,应用生物信息学方法分析和预测了其理化性质、蛋白质二级及三级结构。测序结果表明,水牛PHB基因编码区全长948bp,推测编码272个氨基酸,理论蛋白质相对分子质量29 830,等电点为5.58。多重序列比较分析显示,水牛PHB基因核苷酸序列与牛、野猪、羊、黑猩猩、人、小鼠等相应序列相似性分别为99.4%,94.3%,97.8%,92.8%,92.9%,89.6%;系统进化树分析结果推测,PHB基因在不同物种以及进化过程中具有高度的保守性。QRT-PCR分析结果显示,水牛PHB基因在垂体、大脑、肝脏、卵巢、肌肉、肾脏和睾丸组织具有不同程度的表达,其中在肾脏表达量最高,肝脏、睾丸、卵巢和垂体次之,肌肉表达最低。对高、低活率水牛精子样本PHB基因表达进行了定量检测,结果显示高活率精子中PHB基因表达显著高于低活率精子(P0.05)。Western blot分析结果发现,高、低活率精子样品的β-actin蛋白条带清晰一致,PHB蛋白在高、低活率精子样品的表达差异显著,低活率精子样品的PHB蛋白表达下调,这与mRNA水平的检测结果一致。本研究为阐明PHB基因在水牛精子发生过程中的作用及其对水牛精子活率的影响奠定了基础。     

水牛繁殖生物技术研究进展

水牛的繁殖受诸多因素的影响。为提高其繁殖力 ,多种繁殖生物技术得到大量研究。水牛精子的稀释、冷冻及人工授精已基本程序化 ,并得到了广泛推广。通过超数排卵和胚胎移植的研究 ,获得了水牛胚胎移植的后代。水牛卵母细胞的采集、体外成熟、体外受精和受精胚的培养也得到大量研究 ,并成功产出体外受精水牛。在水牛胚胎冷冻和移植的研究方面也取得成功并产犊。细胞核移植、基因组和基因图谱等新兴生物技术在水牛上也得到初步研究。随着转基因等生物技术的进一步发展 ,水牛的遗传资源将得到更好的开发     

水牛冷冻精液稀释液中添加SOD、GSH对精子品质的影响

试验对在水牛精液稀释液中加入SOD和GSH对水牛精子活率、顶体完整率、体外受精卵母细胞分裂率、囊胚率和孵化率的影响进行比较研究。300IU／ml SOD结合1．0mM GSH效果要好于单独添加3001U／ml SOD和1．0mM GSH,提高精子的活率和存活时间显著（P〈0．05）,在分裂率和囊胚的孵化率方面也明显高于对照组（P〈0．05）。从试验结果可以看出SOD和GSH都能明显减缓水牛精子的死亡时间。且SOD与GSH组合在减缓水牛精子的死亡速度方面效果更为明显。     

世界首例通过分离XY精子进行性别控制的试管水牛在广西涎生

2006年2月13日，广西水牛研究所的一头杂交母水牛，通过分离XY精子，进行性别控制产下了雌性水牛双犊。这在世界尚属首例。     

水牛试管繁殖技术难度大

水牛试管繁殖技术是２０世纪８０年代前后发展起来的体外受精（invitrofertilizationIVF）技术的一个分支。IVF技术的要点是把几千万个精子和一个或数个卵子在体外结合，再把受精卵放回母体子宫内，让它发育成一个生命个体。这项技术自１９７８年取得成功之后，人类和大部分家畜都有了试管后代。但是，由于水牛的生殖生理特征，试管水牛繁殖技术仍是生物技术的一个难题。水牛的体外条件卵母细胞质量差、精子体外获能低，因而试管水牛的繁育比黄牛困难得多。尽管１９８２年美国科学家布兰基（Bracket）率先培育出世界上第一胎体外受精的黄…     

不同种、品种牛精子长度的研究

通过染色固定，用显微镜、目尺测定不同种、品种牛精子的总长、头长及头宽，比较黄牛、肉牛、奶牛及水牛精子的长度差异。测定结果精子的总长黄牛为74．62μm，肉牛为72．37μm．奶牛为72．48μm，而水牛为64．84μm。黄牛、肉牛、奶牛精子的总长与水牛精子总长相比差异都极显著，而黄牛、肉牛、奶牛之间没有多少差异。     

水牛和黄牛同种及种间显微授精(ICSI)的初步研究

试验探讨了水牛和黄牛同种及种间显微授精的可行性。体外成熟22~24 h的水牛和黄牛卵母细胞分别注入冷冻/解冻的尼里－拉菲水牛和利木赞黄牛精子,进行同种或种间的显微授精操作,构建的ICSI胚胎一部分培养到16~18 h固定染色检查原核形成情况,另外一部分胚胎培养2~9 d分别记录胚胎的分裂情况及囊胚发育情况。结果发现,水牛同种(水牛+水牛)和水牛异种(水牛+黄牛)显微授精胚胎的双原核率(47.73%和36.67%)、分裂率(68.00%和72.64%)和囊胚发育率(16.44%和22.39%)均无显著差异(P＞0.05);黄牛同种(黄牛+黄牛)和黄牛异种(黄牛+水牛)显微授精胚胎的双原核率(60.00%和45.28%)、分裂率(73.33%和71.31%)和囊胚发育率(28.57%和33.70%)亦无显著差异(P＞0.05)。以上结果表明:①水牛精子注射到黄牛卵子和黄牛精子注射到水牛卵子的种间授精胚胎均可以体外发育到囊胚阶段;②黄牛卵子无论同种和种间显微授精的效果均优于水牛卵子。     

首例转基因克隆水牛在邕问世 广西率先掌握该技术

世界首例转基因克隆水牛在广西大学科研基地金光乳业水牛场呱呱落地。这是继广西大学12月获得世界首例单精子显微授精的转基因水牛、世界首例慢病毒介导的转基因水牛之后的又一杰作。多头转基因水牛的成功诞生,标志着广西已经在国际上率先掌握了转基因水牛制作的一系列技术。