柑橘黄龙病病原培养及分子检测技术研究进展

柑橘黄龙病（Huanglongbing）由韧皮部杆菌属细菌（Candidatus Liberobacter sp.）侵染引起,是柑橘生产上的毁灭性病害,当前正在世界柑橘产区迅速蔓延,已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一。介绍了柑橘黄龙病的症状以及病原的分离培养研究进展,阐述了病原的分子检测技术,包括PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR和LAMP快速检测技术,并对病害的防控进行展望。     

切实强化柑橘黄龙病防控坚决打赢柑橘产业保卫战

柑橘产业是我省贫困山区农民收入的重要来源、脱贫致富的支柱产业,是我省水果千亿产业中的核心产业.当前,柑橘黄龙病对湘南柑橘优势产区已造成较大影响,江永香柚、道州脐橙等柑橘品牌不同程度受害,防控形势较为严峻.我们必须认清形势,强化措施,严防死守,坚决打赢柑橘黄龙病防控阻击战.     

湘南脐橙柑橘黄龙病的PCR检测及内生细菌的分离

为确保湘南脐橙产业发展安全,严格防控柑橘黄龙病,从湘南地区几个脐橙种植园采集柑橘黄龙病疑似病株样品和健康植株样品,利用文献报道的柑橘黄龙病PCR检测常用引物对样品进行分子检测,并从病株组织中分离内生细菌进行分析鉴定。结果表明:在柑橘黄龙病的常规PCR检测中,湘南脐橙总核酸对P400引物的灵敏度最高,是湘南地区脐橙中柑橘黄龙病害常规PCR检测的最佳引物,其次为P535引物,而OI和16S这2对引物的灵敏度较低;对脐橙中柑橘黄龙病病株组织内生细菌的分离鉴定发现,柑橘中可培养内生细菌主要归类为7个属,分别为短杆菌属(Curtobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、异常球菌属(Deinococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus);其中,LB和1/10LB培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和芽孢杆菌属;而脐橙树叶汁培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和微杆菌属。     

柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法的建立

黄龙病是世界柑橘产业的毁灭性病害,引起柑橘黄龙病的病原分为亚洲种、非洲种和美洲种共3个种,目前我国柑橘黄龙病均由亚洲种引起,建立一套快速检测技术对我国柑橘黄龙病的防控具有重要意义.本研究根据柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA基因序列设计引物,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)的检测方法,并评价了该方法的灵敏度和检测准确性.结果表明,本研究所建立的柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法特异性强、灵敏度高、操作过程简便,检测灵敏度比常规PCR提高10倍,为基层农技人员开展柑橘黄龙病的快速检测提供了一种新方法.     

湖南省柑橘黄龙病菌的PCR检测及序列分析

从湖南省8个市(县)采集柑橘黄龙病疑似植株的叶片,以特异引物进行PCR检测。结果表明:8个市(县)所采样品均检测到了柑橘黄龙病病原菌,其中新宁、武冈、隆回、洞口和通道县为首次发现,各地病原菌序列与柑橘黄龙病亚洲种(M94319)的同源性高达99.1%～100%;不同地区的柑橘黄龙病病原菌存在微小差异,其中新宁与通道县病株差异稍大。这说明由特异性引物建立的PCR检测技术具有特异性强、准确率高、可重复性好等特点,可用于柑橘黄龙病的快速检测。     

肇庆、云浮地区砂糖橘黄龙病PCR 快速检测技术的建立

以砂糖橘叶脉为材料,采用微量提取法提取DNA,利用柑橘黄龙病病原的特异引物对其16S rDNA 片段进行PCR 扩增,将其扩增产物纯化、回收,筛选含有黄龙病病原16S rDNA 片段的阳性克隆进行序列测定,初步建立了适用于肇庆、云浮地区砂糖橘黄龙病PCR 检测技术,并通过该技术对肇庆、云浮地区砂糖橘黄龙病的发生情况进行了初步了解。结果表明：应用16S rDNA 检测砂糖橘黄龙病在肇庆、云浮地区是可行的,肇庆、云浮地区各县砂糖橘产区均检测到感染黄龙病植株。     

梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用

本文利用TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测,并与常规PCR检测进行对比。结果表明,实时荧光定量PCR用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染。采用2种方法对梯度稀释的阳性样本进行检测发现,实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR更高,能够检出样品中痕量的病原菌。本研究在梅州地区建立了以实时荧光定量PCR方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测,可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、快速的黄龙病检测技术。     

柑橘黄龙病分子生物学检测方法研究进展

柑橘黄龙病是世界范围内极具破坏性的危险性病害,可防可控但不可治,加强黄龙病早期诊断,探索快速、准确、高灵敏度、高特异性的检测技术对防止该病害的传播蔓延具有极其重要的意义。综述了国内外关于柑橘黄龙病分子生物学检测诊断方面的研究进展,介绍了该领域各检测方法的特点和存在问题,主要介绍了PCR检测技术,提出了大批量黄龙病样品检测适宜选用巢式PCR检测方法。     

柑橘黄龙病检测方法研究进展

黄龙病是柑橘生产上的一种毁灭性病害,该病在北美、南美、西亚、东亚和南亚的一些国家和地区时有发生,造成巨大的经济损失,严重威胁着世界柑橘产业。柑橘黄龙病的传统检测方法有病害田间诊断、指示作物鉴定、病原显微镜观察、血清学、DNA-DNA杂交和PCR检测等方法。近年来,美国一些科学家把高光谱图像技术应用在柑橘黄龙病检测领域,提高了检测速度,降低了检测成本。综述了国内外关于柑橘黄龙病检测诊断方面的研究进展,介绍了该领域传统检测方法的特点和存在问题以及高光谱图像检测技术的主要特点,着重介绍了高光谱图像技术在黄龙病检测方面的最新应用技术、设备和实例。提出了柑橘黄龙病诊断领域,在实现无损检测的前提下,降低成本、提高检测实时性和诊断速度的发展趋势。     

柑橘黄龙病快速诊断与检测技术研究进展

综述了田间症状诊断、指示植物鉴别、基于淀粉-碘反应的诊断、基于高光谱成像的无损检测、免疫学检测、基于核酸的分子检测等柑橘黄龙病检测技术的优缺点,并指出巢式PCR、定量PCR与LAMP技术等基于核酸的分子检测技术,因其检测灵敏度高,可以对无症样品进行检测,在柑橘黄龙病的早期检测上具有良好的应用前景,同时提出开发一种无需DNA模板制备的柑橘黄龙病LAMP检测技术,将为田间大规模的样品提供快速、准确、高效、低成本、高灵敏度的检测手段,具有重大的应用价值。     

柑桔黄龙病PCR检测技术体系优化分析

根据柑桔黄龙病病菌亚洲种16S rDNA基因序列设计特异引物,建立了检测柑桔黄龙病的快速PCR方法,并研究了PCR体系的各主要组分对PCR反应的影响,确立了黄龙病菌的PCR检测优化体系。应用PCR检测方法对大田植株及柑桔脱毒苗进行抽样检测,结果表明:PCR检测优化体系具有快速、灵敏度高、重复性好、检测成本低等优点,适用于柑桔黄龙病的早期诊断及无病毒苗木的大量检测。     

柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布格局与参数特征应用研究

为了揭示浙江柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布信息和染病特征,2017—2018年对7个柑橘黄龙病发生样地2 900株橘树进行黄龙病菌PCR检测,按10株1样方取得290组样本资料,应用聚集度指标法对其空间分布型进行数据测定,结果达到C>1、I>0、K>0、C_A>0、M^*/$\bar{x}为了揭示浙江柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布信息和染病特征,2017—2018年对7个柑橘黄龙病发生样地2 900株橘树进行黄龙病菌PCR检测,按10株1样方取得290组样本资料,应用聚集度指标法对其空间分布型进行数据测定,结果达到C1、I0、K0、C_A0、■,均为聚集分布格局,表明柑橘黄龙病菌PCR阳性病株田间分布趋向聚集分布。经Iwao的M~*-线性模型回归检验表明,柑橘黄龙病菌PCR阳性病株空间分布的基本成分是个体群,病株间相互吸引,表现有明显的发病中心;经Taylor的■幂法则模型检验分析表明,黄龙病菌阳性病株的空间分布具有密度依赖性,阳性病株密度越高越趋向聚集分布,即聚集强度随阳性率上升而增强。其理论抽样数模型为■及序贯抽样公式为T_n=1.6976/[D■+0.9296/n]。应用这些参数特征对提高田间柑橘黄龙病早期预警效率和决策防控具有良好的指导意义。     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

【目的】筛选出一种快速高效获取柑橘黄龙病病原DNA的提取方法,为黄龙病亚洲种病原的检测奠定基础。【方法】选取5份疑似黄龙病症状柑橘叶片样品,分别采用4种试剂盒（快捷型基因组DNA提取系统、新型植物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、快速DNA提取扩增套装）及CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA,并用柑橘黄龙病亚洲种的16SrDNA特异引物fD1／fD2和01I／012c进行PCR扩增,DNA提取产物及PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳上检测。【结果】快捷型基因组DNA提取系统获得的DNA质量最好,植物基因组DNA提取试剂盒和CTAB法提取DNA方法提取得到的DNA质量较好,新型植物基因组DNA提取试剂盒所获得的DNA质量较差,快速DNA提取扩增套装所获得的DNA质量最差。除陕速DNA提取扩增套装外,其余4种DNA提取方法均扩增出黄龙病亚洲种病原。【结论】快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒操作简单快捷,耗时短,提取的DNA效果较好,能够满足黄龙病病原PCR检测的要求。     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

【目的】筛选出一种快速高效获取柑橘黄龙病病原DNA的提取方法,为黄龙病亚洲种病原的检测奠定基础。【方法】选取5份疑似黄龙病症状柑橘叶片样品,分别采用4种试剂盒（快捷型基因组DNA提取系统、新型植物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、快速DNA提取扩增套装）及CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA,并用柑橘黄龙病亚洲种的16S rDNA特异引物fD1/fD2和OI1/OI2c进行PCR扩增,DNA提取产物及PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测。【结果】快捷型基因组DNA提取系统获得的DNA质量最好,植物基因组DNA提取试剂盒和CTAB法提取DNA方法提取得到的DNA质量较好,新型植物基因组DNA提取试剂盒所获得的DNA质量较差,快速DNA提取扩增套装所获得的DNA质量最差。除快速DNA提取扩增套装外,其余4种DNA提取方法均扩增出黄龙病亚洲种病原。【结论】快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒操作简单快捷,耗时短,提取的DNA效果较好,能够满足黄龙病病原PCR检测的要求。     

柚类果树叶片斑驳病的病原鉴定与检测

柚类是柑桔中的一类重要品种,在我国有广泛的分布、近年来,在福建等产区发现柚类病树日趋２增多、基病状为叶片斑驳、小果、植株矮化、暂称为叶片斑驳病。本有通过组织嫁接从病柚树传染到柚健苗和芦柑健苗。在电下观察,其病原功体的形态和细胞壁构造与柑桔黄龙病的病原十分要似。应用柑桔黄龙病病原ＤＮＡ的特异性引物进行ＰＣＲ试验产生的ＰＣＲ产物,其分子量与柑桔黄龙病病原ＤＮＡＰＣＲ产物的基本相同,为５６３ｂｐ;以及应     

梅州市柑橘黄龙病的调查与综合防控措施

柑橘黄龙病(cirtus Huanglongbing,HLB)是细菌性病害,本文作者通过聚合酶链式反应(PCR)对梅州地区柑橘黄龙病发生情况进行调查,对梅州地区一共761个疑似黄龙病样本进行检测分析,并在此基础上提出梅州市柑橘黄龙病的综合防治策略,为梅州的柑橘产业发展提供参考。     

应用PCR和测序技术诊断吉安和抚州两地区的柑橘黄龙病

柑橘黄龙病是国内植物检疫对象,明确其地理分布对控制黄龙病扩散具有重要意义.于2008年10～11月赴吉安和抚州可疑黄龙病桔园采集30份病样,其中吉安地区19份,抚州地区11份,采用PCR方法对这30份样品进行柑橘黄龙病菌检测,结果从吉安地区4个病样(遂川县1个、万安县2个、泰和县1个)和阳性对照中扩增到预期的长约700 bp的DNA片段,其他样品和阴性对照中则没有预期的DNA片段产生.选择遂川双桥1号、万安窑头1号和泰和文田4号3个分离物的PCR产物进行纯化、测序,从中各获得一段长为654 nt的序列.经同源性比较发现,这3条DNA序列不仅完全相同,而且它们与已报道的柑橘黄龙病菌亚洲种国内外所有分离物的对应序列的同源性也均为100%,但它们与已报道的柑橘黄龙病菌非洲种核苷酸序列同源性只有79.6%,结果表明上述3个柑橘黄龙病菌分离物均属于亚洲种.柑橘黄龙病菌亚洲种在吉安地区遂川、万安和泰和县存在的发现,希望能引起有关部门足够的重视.     

柑橘黄龙病的传播途径及鉴定方法

在生产中,柑橘类果树由于长期无性繁殖,往往感染1种或几种病毒、类病毒病害。柑橘黄龙病是一种毁灭性病害,大多数柑橘品种都易感病,主要发生在亚洲和非洲的40多个国家。全面认识柑橘黄龙病的传播途径及鉴定方法,对柑橘类果树生产具有重要的指导意义。     

柑桔黄龙病防控技术研究与应用

根据柑桔黄龙病病原PCR检测结果,分析其病原检出率不高与检测方法、检测部位等相关,提供了"红鼻果"作为芦柑黄龙病田间诊断的依据。通过田间调查,分析总结了至2000年前永春县柑桔黄龙病长期未蔓延危害的原因在于果园管理均衡,施药次数较多,柑桔木虱没有大量生存繁衍的空间;而近年柑桔黄龙病蔓延危害的主要原因是"三农"状况发生变化,劳力转移,失管果园多,病源多、柑桔木虱大量危害,病害迅速传播。论述了近年永春县柑桔黄龙病防控技术的实践应用与取得的成效;指出柑桔规模化连片种植,分散管理,难以统一落实防控措施是黄龙病防控工作的难点。探讨了黄龙病产区发展柑桔生产的措施。