梅花鹿茸鉴别和质量评价方法概述

文中结合近年来有关文献,将梅花鹿茸较常用的鉴别方法(传统经验鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、光谱鉴别、荧光鉴别、DNA分子鉴别)和质量评价方法(传统方式的感官评价、色谱法和光谱法)进行综述。     

梅花鹿茸和马鹿茸中牛磺酸的测定

根据牛磺酸的分子结构特性,设计一个２１ｍｉｎ短程序利用氨基酸自动分析仪分析梅花鹿茸、马鹿茸各部位中牛磺酸各部分的含量。在牛磺酸浓度为１００ｎｍｏｌ／ｍＬ时,峰位和峰面积的变异系数分别为０１２％和１３５％（ｎ＝６）。对不同浓度的牛磺酸加标回收实验,回收范围为９６８％～１０１６％,表明本法准确可靠、快速、简便。     

梅花鹿茸重相关基因差异表达分析

通过分析不同茸重梅花鹿茸的差异表达基因,筛选可用于区分鹿茸重量的基因。以东丰县梅花鹿为试验对象,同一饲养条件下,采集不同梅花鹿的茸血,进行高通量测序,对差异表达基因进行GO、KEGG富集分析及qRT-PCR验证。结果表明：共有84个差异基因,其中,44个基因上调,40个基因下调。通过GO分析,这些基因共富集到318个条目,其中,分子功能118个、生物过程138个和细胞组分62个;通过KEGG分析,富集于细胞黏附分子(CAMs)、抗原加工递呈、Ⅰ型糖尿病等106条通路。通过P值筛选出8个基因进行qRT-PCR验证,趋势与测序数据相符,TRPC6基因在高产组的相对表达量高于低产组(P<0.01),有望成为筛选种公鹿的候选基因,为后续梅花鹿的良种选育提供理论基础。     

哺乳动物SRY基因研究进展

 尽管SRY基因的发现已有10多年，但到目前为止，人们还没有弄清楚SRY基因是如何调控胚胎双性腺发育成睾丸的。经过10多年的研究，人们对SRY基因有了新的认识。作者综述了SRY基因的功能，SRY蛋白以及SRY基因在性腺中表达的最新研究进展。     

哺乳动物SRY基因研究进展

尽管SRY基因的发现已有10多年，但到目前为止，人们还没有弄清楚SRY基因是如何调控胚胎双性腺发育成睾丸的。经过10多年的研究，人们对SRY基因有了新的认识。作者综述了SRY基因的功能，SRY蛋白以及SRY基因在性腺中表达的最新研究进展。     

基于SRY基因分析梅花鹿的遗传多样性及父系类型

试验旨在研究梅花鹿SRY基因的遗传多样性及其父系类型。选取东北亚种、北海道亚种、本州亚种、指名亚种、屋久岛亚种5个亚种的144个个体,利用试剂盒和传统酚/仿(1∶1)法进行DNA的提取,采用PCR扩增和直接测序法分析梅花鹿的核苷酸多样性(Pi)、单倍型多样性(Hd)、遗传距离及系统进化关系。结果显示,试验所获序列长度为1 613bp,在第47、62、602、1 148、1 569、1 604bp处共检测到6个SNPs多态位点,占核苷酸总数的0.3%,碱基替换以碱基转换为主。通过6个SNPs多态位点确立了6种单倍型:Hap-1、Hap-2、Hap-3、Hap-4、Hap-5和Hap-6,其中Hap-4、Hap-5和Hap-6为新发现单倍型。遗传多样性由高至低依次为:指名亚种、屋久岛亚种、东北亚种、本州亚种、北海道亚种。各亚种间遗传距离最小为北海道亚种与本州亚种的距离(0.000056),最大为东北亚种与指名亚种的距离(0.001733)。基于单倍型利用邻接法构建系统进化树,结果显示,与日本梅花鹿相比,东北亚种与马鹿关系更近,东北亚种存在两大分支,日本梅花鹿各亚种间无明显分支,其他单倍型均是由Hap-3进化而来,单倍型最小跨度网络图与系统进化树一致。结果表明,东北梅花鹿存在两大父系类型,日本梅花鹿存在一个父系类型,单倍型Hap-3是日本梅花鹿的原始单倍型。     

饲粮粗蛋白质、能量水平对3岁梅花公鹿鹿茸生长和体增重的影响

为探讨 3岁梅花鹿生茸期饲粮适宜营养水平 ,本研究采用 2 (CP∶2 1%和 19% )× 2 (GE∶16 74MJ/kg和 15 90MJ/kg)二因子交叉设计 ,选用 3岁 (二锯 )梅花公鹿 6 7头 ,分为 4个试验组 ,进行了饲养试验和消化试验。试验结果表明 ,饲粮蛋白质水平对鹿体增重有显著影响 (P <0 0 5 ) ,在本试验所设能量浓度范围内 ,饲粮蛋白质水平为 19%处理组鹿体增重显著高于 2 1%蛋白组 ;鹿茸产量组间差异不显著 (P >0 0 5 ) ;饲粮粗蛋白质水平对蛋白质消化率和能量消化率均有显著影响 (P <0 0 5 ) ;3岁梅花鹿生茸期饲粮中能量、蛋白质适宜水平分别为 15 9～ 16 7MJ/kg (GE)和 19% (CP) ;平均每头鹿每天对消化能和可消化蛋白质的需要量分别为 2 9 9～ 31 3MJ和 388～ 394 g。     

东北梅花鹿茸二杠与三杈茸中总磷脂和牛磺酸含量的比较分析

分别对 8对梅花鹿茸二杠茸与三杈茸中总磷酯和牛磺酸的含量进行了比较分析。结果表明 ,东北梅花鹿茸二杠茸与三杈茸之间的总磷脂和牛磺酸含量差异不显著 (P >0 .0 5 )。     

利用Y染色体SRY基因分析马鹿的父系起源和遗传多样性

试验旨在从分子水平上研究中国马鹿的父系起源结构和遗传多样性水平,判断各种群间的系统发育关系和亲缘关系远近。通过DNA提取、PCR扩增和直接测序的方法,对天山马鹿、阿尔泰马鹿、塔河马鹿、东北马鹿等11个群体共159头马鹿的SRY基因序列进行了检测和分析,计算碱基组成、核苷酸多样性（Pi）、单倍型多样性（Hd）以评估遗传多样性,构建单倍型网络图;以白唇鹿为外群,用邻接法（NJ）和最大似然法（ML）构建系统进化树,探讨马鹿的聚类及遗传多样性。结果显示,所获序列长度为1 615 bp,在基因中共鉴定出18个SNPs多态性位点,占核苷酸总数的1.11%,根据多态性位点鉴定出14个单倍型,优势单倍型为Hap-1,所占频率35.84%,为天山马鹿、阿尔泰马鹿、阿拉善马鹿、塔河马鹿、东北马鹿、甘肃马鹿、北美马鹿和高产鹿王种群的共有单倍型。其中,阿拉善马鹿、塔河马鹿、甘肃马鹿、川藏马鹿、北美马鹿和高产鹿王均具有独有单倍型。单倍型多样性介于0~0.857,核苷酸多样性介于0~0.00272,各亚种间遗传距离最大的是塔河马鹿与西藏马鹿（0.002406）,最小的是阿拉善马鹿与青海马鹿（0.000124）。基于邻接法和最大似然法构建的系统进化树一致,显示11个野生马鹿种群间共存在3个分支,支系S1包含全部马鹿种群,塔河马鹿、甘肃马鹿、北美马鹿和高产鹿王构成支系S2,北美马鹿构成支系S3,单倍型最小网络图与系统进化树一致。表明各马鹿种群之间的遗传多样性存在差异,塔河马鹿、高产鹿王和甘肃马鹿分别存在2个父系类型,北美马鹿存在3个父系类型,其他马鹿种群只存在1个父系类型,Hap-1在单倍型组S1中处于核心位置,其他单倍型分散分布于其周围,推测Hap-1为马鹿种群中较为原始的单倍型。     

梅花鹿茸不同生长期顶端茸皮组织NGF基因DNA甲基化差异研究

以梅花鹿茸生长过程的3个重要时期——小鞍子(前期)、二杠(中期)、三杈(后期)的顶端茸皮组织为试验材料,采用BSP法对前、中、后期鹿茸茸皮组织NGF基因启动子区进行DNA甲基化检测与甲基化率的比较分析。结果表明：NGF基因在前、中、后期的茸皮组织均发生不同程度的甲基化,甲基化率分别为(23.99±0.66)%、(22.22±1.78)%和(15.10±1.55)%,但它们之间的甲基化率无显著差异(P>0.05)。NGF基因启动子区的甲基化区域共有30个CG位点,在35,39,42,52,66,95 bp处均发生甲基化,但差异不显著(P>0.05);在115,125,135 bp处前期与后期甲基化率差异显著(P<0.05),前期与中期、中期与后期均差异不显著(P>0.05);223,225,227 bp处的甲基化率前期与中期均显著高于后期(P<0.05),前期与中期差异不显著(P>0.05);在246 bp处甲基化率前期与中期、中期与后期、前期与后期均差异极显著(P<0.01);在347 bp处甲基化率前期显著高于中期与后期(P<0.05),中期与后期甲基化率差异不显著(P>0.05)。     

梅花鹿茸不同生长阶段顶端茸皮组织MEF2C基因的表达分析

为探讨肌细胞增强因子2(MEF2C)基因在梅花鹿茸生长发育过程中的生物学作用,以梅花鹿茸为试验材料,对其进行T-A克隆,以获得MEF2C基因的cDNA序列,再结合实时荧光定量PCR技术,对梅花鹿茸不同生长阶段(前、中、后期)顶端茸皮组织层MEF2C基因的表达量差异进行分析,结果表明：成功克隆出的梅花鹿MEF2C基因的完整编码区,全长为1 302 bp,共编码433个氨基酸,其中丝氨酸含量最高,占氨基酸总量的13.4%;蛋白质相对分子质量为46 898.44,理论等电点pI值为8.69,脂肪系数为65.77;分子式为C_(2011)H_(3210)N_(600)O_(654)S_(20),总原子数为6 495,不稳定系数为51.83,亲水性平均值为-0.662,MEF2C基因为不稳定的亲水蛋白;二级结构以无规则卷曲为主;亚细胞定位预测为细胞核内;通过Blastp功能对比显示,梅花鹿MEF2C基因与马鹿的同源性最高,为99.54%,与牛、羊的同源性也都超过99%。实时荧光定量结果分析表明,MEF2C基因在鹿茸生长不同阶段的顶端茸皮组织中都有表达,但表达水平不同,中期表达量是前期表达量的3.210 6±0.183 5倍,后期表达量是前期表达量的3.620 1±0.195 1倍,且前期与中期的表达量、前期与后期的表达量存在显著差异(P<0.05),而中期与后期的表达量差异不显著(P>0.05)。     

利用性别决定基因(SRY)进行牛早期胚胎性别鉴定的研究

利用牛性别决定基因(SRY)和酪蛋白αs1基因(CSN1S1)分别设计雄性特异性引物和内标引物,两对引物均各设计一对嵌套式引物进行多重PCR和多重巢式PCR,用于牛早期胚胎性别鉴定。SRY基因和CSN1S1基因外、内引物扩增片断长度分别为357bp、232bp、528bp和367bp。实验结果表明,这两个引物组合建立的多重PCR扩增体系均有较高的扩增稳定性和准确率,但在常规PCR体系中,它们的灵敏度均不高(约50pg,相当于16个细胞的DNA量),这在一定程度上限制了其在胚胎性别鉴定中的应用。而由二者建立的巢式PCR灵敏度可达到5pg,故可以很好地满足胚胎性别鉴定的需要。     

利用随机扩增多态性DNA指纹技术对猪链球菌进行基因分型

通过优化反应条件和筛选随机引物，应用100条随机引物对分离的20株猪链球菌做随机扩增多态性DNA（RAPD）分型研究。结果表明，有27条引物呈现良好的多态性和稳定性，可产生稳定，复杂的指纹图谱。采用SPSS10.0软件分析了不同菌株之间的遗传距离，绘制出了菌株间的亲缘关系树状图，结果，20株猪链球菌被分为4个聚类群。     

利用SSR标记对家蚕耐氟基因进行连锁定位分析

采用家蚕耐氟品系T6和敏感品系733新组配正反交群体(733新×T6)×733新和733新×(733新×T6),分别记作BC1F和BC1M。基于雌性家蚕染色体不发生交换,用已构建的家蚕SSR连锁图上的标记对耐氟基因(dominant endurangce to fluoride,Def)进行了定位及连锁分析。在28个连锁群上都找到了多态标记,其中只有3个位于12连锁群上的SSR标记与耐氟基因连锁。根据第12连锁群上已有的微卫星序列,寻找其所在的Scaffold上的其它SSR位点,并设计引物,找到一个新的多态性SSR标记。BC1F群中的所有耐氟个体均表现出与(733新×T6)F1相同的杂合型带型,而所有敏感个体带型与亲本733新一致,均为纯合型,说明家蚕耐氟性状是由位于第12连锁群上单个显性主效基因控制的。利用另一个群体BCM构建了耐氟基因的遗传连锁图。     

利用egfp基因对中华蜜蜂卵进行显微注射的初步研究

利用显微注射法对中华蜜蜂0～12h卵注射绿色荧光蛋白基因,注射后的卵采取人工繁殖和蜂群自然培养两种方式饲养,结果蜜蜂卵注射后存活率低,绿色荧光蛋白基因表达不理想;实验探讨了中华蜜蜂卵显微注射转基因技术,为今后蜜蜂显微注射转基因研究和改进提供了一定参考价值。     

利用基因检测技术鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜

浙江大学胡福良教授团队采用基因检测技术成功地建立了准确鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法。论文“Authentication of Apis ceranaHoney and Apis mellifera Honey Based on Major Royal Jelly Protein 2 Gene”于2019年1月14日在线发表在国际学术期刊《Molecules》上。中蜂蜂蜜也称“土蜂蜜”,其营养和保健功效深受消费者信赖,然而因产量较低,其市场价格是普通意蜂蜂蜜的好几倍。受利益驱使,一些不法商贩用意蜂蜂蜜冒充或掺入中蜂蜂蜜中以赚取高额利润,给中蜂养殖者以及相关蜂产品企业造成了严重损失,同时引发了消费者的信任危机。因此,如何鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜是当前蜂产品行业亟待解决的一大问题。     

利用12S rRNA基因对四川地区7种牛肉干进行真伪鉴别

笔者针对牦牛线粒体12S r RNA基因设计特异性引物,以市场销售的牦牛肉干为研究对象,建立牦牛肉干中肉源性成分的PCR鉴定方法,并用该方法对四川地区销售的7种牛肉干进行检测。结果表明,所检测样品在440 bp处出现预期条带,检出率为100%。将PCR产物经测序后采用DNAMAN进行序列比对分析,并通过MEGA 5.10软件构建进化树,6份牦牛肉干样本中6份与标注吻合,1份黄牛肉干检测出是牦牛肉。试验表明,牦牛线粒体12S r RNA基因序列分析可用于牛肉干的鉴别,市场销售的牛肉干存在掺假现象。     

利用CRISPR/Cas9技术对鸡AMHR2基因进行精确编辑

为了在鸡基因组上对AMHR2基因进行精确编辑,该研究利用crispr.mit.edu:807网站设计并通过PCR退火拟合获得成对的AMHR2基因靶位点,将靶位点分别整合进pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9载体骨架,构建靶向AMHR2基因的成对CRISPR/Cas9敲除载体。将包含成对靶位点的DNA序列整合进pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP载体骨架,构建与敲除载体对应的双荧光报告载体。载体测序鉴定正确后分别共转染HEK293T细胞与鸡DF-1细胞,通过细胞荧光粗略判断CRISPR/Cas9系统是否工作。随后,利用Puromycin对基因编辑阳性的DF-1细胞进行药物筛选富集,提取细胞基因组进行TA克隆,进一步检测CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统构建成功,且成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统,CRISPR/Cas9敲除系统在DF-1细胞基因组上对AMHR2基因的敲除效率约为60.0%,并在鸡DF-1细胞基因组上实现了AMHR2基因的精确编辑。