利用复合PCR方法同时检测三种转基因水稻

我国在转基因水稻研究方面处于国际领先地位,但由于研究材料扩散到商品化生产水稻中而引起的贸易纠纷时有发生。加强转基因水稻检测与监管,从源头控制转基因水稻基因扩散对于保障生物安全、促进米制品贸易有重要意义。本研究针对我国当前转基因水稻监管重点,结合已有相关检测方法标准,针对三种不同转基因水稻：抗虫水稻TT51-1、抗病水稻M12、抗除草剂水稻LLRICE62,以水稻内源基因RBE4为参照基因,建立转基因水稻四重复合PCR检测方法,可在同一反应体系中同时检测鉴定三种转基因水稻品系,检测限可达250个拷贝。利用此方法可快速地定性检测和鉴定转基因水稻TT51、M12、LL RICE62。     

利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数

微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于泊松分布原理的核酸分子绝对定量技术,在核酸分子的绝对计数/定量领域具有极大的应用潜力。本研究基于ddPCR平台,以转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19和转人乳铁蛋白基因基因山羊(Capra hircus)134为例,建立了转基因生物(genetically modified organisms,GMOs)外源基因拷贝数分析方法,并比较了其与传统的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Southern blot方法的准确性。实验数据表明,T1c-19的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein,Cry1C*)在qRT-PCR和ddPCR测定结果比较一致,约为2拷贝,但已报道的Southern blot分析结果为1拷贝;ddPCR对bar基因的分析结果高于qRT-PCR,分别为2.09拷贝和1.51拷贝。转人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,HLF)山羊134在qRT-PCR和ddPCR的分析结果基本一致,均测得含有1拷贝的HLF基因。研究结果表明,微滴数字PCR方法是一种经济、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,灵敏度和准确性高,将会在拷贝数分析中广泛应用。     

实时荧光PCR检测转基因大豆外源基因的拷贝数

快捷、准确地检测转基因植物中外源基因的拷贝数,是转基因生物育种的重要研究内容,具有较大的应用前景。本研究以7个抗虫BT(Bacillus thuringiensis)和抗草甘膦EPSPS-G10转基因大豆事件为材料,以SYBR Green I为荧光染料,利用实时荧光定量PCR方法,根据PCR反应获得的Ct值与起始模板数的对数值存在线性反比关系这一原理,建立了相关性系数在0.99以上的模板定量标线。通过目的基因与内参基因——大豆肌动蛋白编码基因ACTIN的起始模板量比较,估算出各株系的目的基因拷贝数。数据显示,株系1、2、3和4的2个基因均为单拷贝,株系6的2个基因均有2个拷贝,株系5和7的2个基因的拷贝数为3。利用Southern印迹方法对材料1~4的拷贝数进行验证,结果表明,两者的检测结果基本一致,证明实时荧光PCR检测法是大豆外源基因拷贝数检测中快速有效的方法。实时荧光PCR高效快速检测基因拷贝数,对于大规模转基因株系的外源基因拷贝数检测应用具有重大意义。     

不同转化方法获得的转基因棉花外源基因拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其自身表达水平与遗传稳定性的重要因素.本研究旨在比较农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法等3种常用方法转化同一植物表达载体的转基因棉花(Gossypium hirsutum)中外源基因拷贝数的差异.本文主要采用实时定量PCR技术及相应的PfaffI分析法检测转基因棉花单株拷贝数,并与Southern杂交做了相互验证.实时定量PCR研究结果显示,农杆菌介导法、基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的T0代转化体中,外源基因拷贝数为1～2的单株占群体总数的百分比分别为26.2%、60%和42.8%.外源基因拷贝数为3～5的单株比例分别为47.5%、40%和57.1%.另外,农杆菌介导获得的转基因群体中有高达27.3%的单株整合有5拷贝以上的外源基因,而基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的转基因群体中没有发现5拷贝以上的转基因单株.研究结果表明,基因枪轰击和花粉管通道注射法均能获得较高比例低拷贝(1～3拷贝)的转化体.本研究结果对棉花转基因育种中转化方法的选择有一定的理论指导意义.     

转基因水稻Bt汕优63的整合结构和品系特异性定量PCR方法

为更好地监测转基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)Bt汕优63品系的存在,满足转基因标识管理的要求,同时也为了解决阳性植物基因组DNA不容易获得的问题,本研究采用热不对称交互PCR(TAIL-PCR)、Genome Walking和长链PCR(LD-PCR)方法测定了基因枪转化的转cry1Ab/cry1Ac融合基因水稻品系Bt汕优63的外源插入DNA全序列,构建了含有Bt汕优63 3′旁侧和水稻内标基因gos9序列的标准质粒分子pMDBt63作为标准物质,建立了Bt汕优63实时荧光定量PCR方法.外源插入DNA全长9 818bp,位于水稻基因组10号染色体(AP008214)第5348630位,由8个来源于两个转化质粒的DNA片段组成,其中两个cry1Ab/cry1Ac表达框以正向串连的方式插入.gos9和3′旁侧两个定量标准曲线的相关系数(R2)分别为0.9997和0.9992,扩增效率(E)分别为98.05%和99.46%.每反应100 ng模板DNA的检测限(LOD)为10拷贝,定量限(LOQ)为100拷贝.此外,对已知5%和1%转基因含量的混合样品DNA进行定量检测,结果的平均值分别为4.98%和1.07%.结果表明标准质粒pMDBt63作为标准物质建立的定量方法可用于Bt汕优63的定量检测.     

转基因阿尔巴斯白绒山羊外源DsRed基因拷贝数与外源基因表达的关系

转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测.为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数.结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomealovirus,CMV)启动子:2.80±0.38～13.68±0.16;DsRed基因:1.34±0.04～11.84±0.02;CMV启动子与DsRed连接处:1.58±0.04～19.22±0.38.通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;DsRed基因为P=0.665;CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显著性相关.上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性.另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法.     

小麦转基因株系中外源脂氧合酶抑制基因(Loxi)拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其遗传稳定性及自身表达水平的重要因素。本研究旨在对转外源种子脂氧合酶基因的RNAi序列(RNAi sequence of lipoxygenase gene,Loxi)的小麦(Triticum aestivum)转基因株系中外源基因拷贝数及其种子脂氧合酶活性进行测定分析,以期获得种子脂氧合酶活性显著降低而且外源Loxi能稳定遗传的转基因小麦新种质。采用TaqMan实时定量PCR技术,以小麦内源控制籽粒硬度的主效单拷贝基因Pinb(puroindoline b)为内参基因,对6个转基因小麦TF5代株系外源Loxi拷贝数进行检测;同时以亚油酸为底物对这6个转基因株系种子脂氧合酶活性进行测定。结果显示,内参基因和外源基因扩增的标准曲线相关系数都接近于1,而且都具有合适的扩增效率,其中内参基因Pinb的扩增效率为107.7%;外源Loxi基因的扩增效率为104.5%;6个不同转基因株系中外源Loxi拷贝数不同,最小的为1,最大的为8;亲本品种陕优225和西农889种子脂氧合酶活性分别为(860±28.20)和(1 132±59.80)U;与其亲本材料相比,不同转基因株系种子脂氧合酶活性降低程度也不同(约为其亲本的21%~95%),有5个转基因株系与其亲本相比,酶活显著降低;其中亲本为西农889的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为2、6和8,与其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为32.76%、26.39%和21.05%;亲本为陕优225的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为1、3和6,其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为95.47%、51.06%和37.73%;外源Loxi拷贝数与种子LOX活性呈负相关。说明转基因株系中脂氧合酶基因的RNAi可有效抑制其种子LOX活性。本研究成功获得种子低脂氧合酶活性的转基因小麦材料,并对其外源Loxi拷贝数进行了准确测定;鉴定得到的种子脂氧合酶LOX活性显著降低的转基因小麦株系可为小麦育种提供新的亲本或种质材料。     

抗菌肽Shiva A基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传与表达分析

为进一步明确外源基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传稳定性及目标性状表现,本研究以转双价抗菌肽基因(ShivaA-cecropinB)纽荷尔脐橙(Citrus Sinensis Osbeck)无性繁殖后代植株为材料,通过PCR扩增,Southern杂交和实时定量PCR检测,以及温室抗病性评价分析等,对抗菌肽ShivaA基因在转基因柑橘后代株系中的遗传稳定性进行了研究.结果表明,外源抗菌肽Shiva A基因在转基因及其无性后代中能够稳定整合与表达.Southern杂交分析表明,ShivaA基因在无性繁殖后代基因组中为1个拷贝,而在T0代中为2个拷贝,由此推测T0代植株为混合嵌合体.定量PCR分析表明,ShivaA基因在To代中的表达水平低于其无性繁殖后代.本研究中外源基因的表达与拷贝数的多少成负相关.研究结果为开展转基因柑橘安全性评价提供了有用的实验材料,积累了有效的实验数据.     

花药培养获得转Bt基因抗虫水稻纯系*

采用改良一步成苗法，对转Bt基因水稻(Qryza sativa L.)“克螟稻”与粳稻(O.sativa ssp.japonica)品种秀水63的杂种F1进行花药培养，结果表明：Bt基因不影响花培绿苗分化，但改变绿苗分化进程。对“克螟稻”与秀水63的杂种花培株观察表明，Bt基因按孟德尔规律简单遗传。携带Bt基因与否直接影响花培苗的成活率；潮霉素筛选可增加Bt转基因阳性株的相对比率，但显著降低绿苗率；花培产生的带Bt基因株系与不带Bt基因株系间的农艺性状差异不显著。经培养，成功选育3个抗虫和高产的转基因新品系。     

转植酸酶基因(phyA2)玉米定性、定量PCR检测

转植酸酶基因玉米检测是对转植酸酶基因玉米释放进行有效监管的重要前提和技术支撑。本研究根据转植酸酶基因玉米(Zeamays)外源植酸酶基因phyA2序列设计基因特异性引物,进行了定性、定量PCR检测。定性结果显示,该引物可有效检测植酸酶玉米中phyA2基因,而在其他不含植酸酶基因的材料中则检测不到相应基因,表明该引物具有很高的特异性。以玉米内标准基因玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2基因(zSSIIb)和植酸酶基因phyA2为对象,进行SYBRGreenⅠ染料法荧光定量PCR反应,绘制2种基因扩增循环数-拷贝数标准曲线图,根据混合样品中(zSSIIb)和植酸酶基因phyA2的拷贝数计算样品中的转基因含量,并做熔解曲线分析。结果表明,zSSIIb和phyA2标准曲线相关系数分别为0.998和0.995,相关性较好,两个基因的熔解曲线均呈单峰型,表明引物特异性较强,混合玉米样品(植酸酶玉米含量分别为1%、0.5%和0.1%)中植酸酶玉米含量分别为1.1%、0.54%和0.17%,实测值与理论值接近。本研究建立了转植酸酶基因玉米定性、定量PCR检测体系,可有效地对转植酸酶基因玉米进行检测。     

基因枪介导转化水稻花粉获得转基因植株

植物花粉是一种理想的植物遗传转化材料,利用转化后的花粉授粉,借助于植物胚胎的自然发育获得转基因种子,从而简化转化过程.大量研究表明基因枪是花粉转化的较理想工具,目前基因枪介导的花粉转化只在烟草、油菜等少数作物中获得成功.水稻是世界主要粮食作物,建立一个高效的水稻遗传转化体系对于水稻的遗传改良具有十分重要的意义.     

Creep Deformation Modeling of Glutinous Rice Cakes (Mochi)

The viscoelastic properties of glutinous rice cakes (mochi) made by extrusion at different conditions (water contents of 45–55% and barrel temperatures of 75–95°C) and commercial rice cakes were studied by a creep test. The maximum compliances of extruded mochi were 0.15–4.23 1/kPa. Among the extruded samples, the mochi extruded at 75°C with a water content of 55% was the one that yielded the largest maximum compliance. At the same barrel temperature, the creep compliance increased with the water content. Four models with different numbers of elements (spring and dashpot) were employed to fit the experimental data. The model coefficients were able to provide the corresponding elastic and viscous behavior of the sample. The 3‐element model (a spring in series with a Kelvin‐Voigt model) did not exhibit steady‐state compliance as observed in the experimental data. The 4‐element (Burger's model), modified 4‐element (an approximation of Burger's model), and 6‐element model (adding one more Kelvin model to the Burger's model) yielded R² > 0.99. Results showed that the 4‐element model was adequate to describe the creep behavior of mochi.     

硒肥对水稻生长及其重金属累积的影响

以大田水稻作为研究对象,分析了不同硒肥量对水稻生长特性及重金属(砷、铬、镉、铅)累积的影响,探讨了通过施硒降低重金属在水稻可食部分含量的可行性。结果发现:施用不同量硒肥(30、60和120 kg/hm2)对水稻分蘖数、株高、单株干物重和产量有促进作用,但差异不显著。施用120 kg/hm2硒肥显著增加了大米中的总硒、无机硒及有机硒的含量,并使有机硒比例增加了16.6%。施用120 kg/hm2硒肥有效抑制了水稻穗部铬和镉的累积量(53%和45%),而对铅无明显抑制作用。施用硒肥促进了硒向精米、糠中转移,同时有效降低了精米中镉、铬、铅的累积量。     

转基因大豆MON89788基体标准物质的研制

转基因产品成分检测是转基因生物安全管理和标识的重要支撑,而转基因生物标准物质是获得准确、可靠、具有可比性检测结果的保证.转基因大豆(Glycine max) MON89788为我国批准进口用作加工原料的农业转基因生物,因此,制备转基因大豆MON89788基体标准物质是对其进行安全管理所必需的.本研究通过将转基因大豆MON89788和其受体材料A3244分别冷冻研磨成粉末,按质量分数称量配制,得到转基因含量为49.3 g/kg的标准物质.采用方差分析法(F检验法)进行均匀性检验,统计量F值为1.618,小于临界值F(0.05,11,24)标准物质均匀性良好;短期稳定性考察结果表明,标准物质可在常温下稳定储存4周,在-20℃下长期稳定性达到30个月.本批MON89788基体标准物质有两个特性量值,一是基于重量法配比混合的粉末质量分数,量值为49.3 g/kg,扩展不确定度为2.0 g/kg;二是基于qRT-PCR 8家实验室联合定值的转基因DNA与总DNA的质量分数,量值为49.8 ng/μg,扩展不确定度为5.9 ng/μg.本批标准物质每瓶1.0 g,使用时最小取样量为100mg,可用于对转基因大豆MON89788进行定性和定量检测,以及转基因大豆MON89788特异性检测方法的评价和实验室质量控制.本研究为我国转基因检测基体标准物质的研制提供了理论基础和技术支持.     

Rice albumin N-terminal (Asp-His-His-Gln) prevents against copper ion-catalyzed oxidations

Chromatographic separation of soluble proteins from rice (Oryza sativa L.) yielded a major albumin protein (16 kDa), with the DHHQVYSPGEQ sequence in the N terminus, showing antioxidant action. The rice albumin was more potent than other rice proteins in preventing Cu2+-induced low-density lipoprotein (LDL) oxidation. Additionally, it also exhibited a remarkable suppression of HOCl oxidation. In a further study, albumin inhibited Cu2+-induced oxidation of LDL in a stoichiometric manner with an EC50 value of 4.3 microM, close to that of serum albumins. Moreover, after digestion with trypsin or chymotrypsin, it maintained its antioxidant action. In an experiment to see the involvement of the N terminus in antioxidant action, a synthetic tetrapeptide, equivalent to the N terminus DHHQ, was found to inhibit Cu2+-induced LDL oxidation or degradation of apolipoprotein B, similar to that of rice albumin. In mechanistic analyses, the action of rice albumin or tetrapeptide is primarily due to the removal of Cu2+, as suggested from its inhibitory effect on Cu2+/diphenylcarbohydrazide (DPCH) complex formation. However, despite its similar inhibitory effect on Cu2+-induced oxidation of LDL, rice albumin was less effective than serum albumin in inhibiting Cu2+/DPCH complex formation, suggesting that the number of Cu2+-binding sites in rice albumin may be less than that in serum albumins. Taken together, rice albumin exerts a potent preventive action against Cu2+-induced oxidations, which is due to the Cu2+ binding by DHHQ in the N-terminal sequence. Such a role as a Cu2+ chelator would add up to the application of rice albumin protein.     

A Reference Population-Based Conformance Proportion

Conformance proportion is a useful index in agricultural, biological, and environmental applications, which is defined as the proportion that a characteristic of interest falls in an acceptance region of a specification. In practice, however, the acceptance region may not be available when employing the regular conformance proportion. In this article, we propose a new index in which the acceptance region is obtained from a reference population. Furthermore, we develop approaches to constructing confidence limits for the proposed conformance proportion using the concept of a fiducial generalized pivotal quantity. We first consider the simple situation that the characteristic is assumed to be a univariate normal random variable. Then we extend it to the one-way random effects model. The proposed method is evaluated through simulation study and real data analysis. It is shown that our proposed new index and its statistical inference are easy to implement and reasonably satisfactory for most applications.Supplementary materials accompanying this paper appear on-line.     

稻茬高度影响轮作紫云英生长及还田效应

大田试验条件下,研究了水稻机械收割不同留茬高度(15cm 、30cm 、40cm,分别标注低茬、中茬、高茬)对轮作紫云英生长、养分积累以及翻压还田后土壤养分、化学性状和微生物量等的影响。结果表明：稻茬高度显著影响轮作紫云英生长、养分积累以及翻压还田效果。紫云英单位面积株数随留茬高度的降低而显著减少；除单株分枝数外,植株株高、茎粗、单株鲜、干重均表现为高茬处理＞中茬处理＞低茬处理,高、低茬处理间差异显著或极显著。产草量受稻茬高度影响明显,单位面积鲜、干草产量均随稻茬高度的降低而显著减少,高茬处理的紫云英鲜、干草产量均最高,分别达到19.22t.hm_^-2和3.27 t.hm_^-2,较低茬处理每公顷增加15.21 t和2.53 t。不同稻茬高度处理的紫云英植株碳及氮、磷、钾含量无显著差异,植株养分积累量则随稻茬高度增加而显著增加,各养分积累量变化趋势一致；不同处理紫云英翻压还田后土壤pH值变化差异不显著,但均较试验前略有上升；土壤电导率则表现为高茬处理大于中、低茬处理,处理间差异极显著; 翻压后土壤养分变化差异较大,各养分含量均表现为随水稻留茬高度降低而减少的趋势,高留茬处理土壤的有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾含量分别较低留茬处理增加41.51%、27.35%、34.96%、68.78%、82.12%。不同处理紫云英翻压还田后,土壤可培养微生物数量存在差异。三大类微生物细菌、真菌、放线菌的数量均以高茬处理最高,除放线菌外,差异均达显著水平,其中,对细菌数量的影响最为明显,高茬处理极显著大于中、低茬处理,中、低茬处理间差异显著。综上,水稻留高茬(茬高40cm)轮作紫云英可获得较高的生物量和养分积累,翻压还田后土壤培肥效果显著优于中、低茬(茬高≦30cm)收割的处理。     

转基因玉米NK603基体标准物质研制

由于转基因标准物质的缺乏,无法保证检测结果的准确、可靠和可比。本研究将筛选后的转基因玉米(Zea mays)NK603 阳性材料及受体进行研磨筛分,粒径测定结果表明,研磨后的粒径大小为 100 μm左右。采用重量法配置了 3 个不同水平的转基因玉米基体物质,应用实时荧光定量 PCR 方法对研制的标准物质进行均匀性和稳定性检测,统计结果表明,所研制的基体标准物质均匀性良好;在 4 ℃保存条件下,一年内未发现不稳定现象。重量法确定的标准值和扩展不确定度(k=2)分别为(0.50±0.10)%、(1.00±0.35)%和(5.00±0.35)%。同时选择 7 家实验室进行协同验证,结果表明,研制的转基因玉米 NK603 基体标准物质量值准确可靠,与国外标准物质相比,不确定度水平相当。本实验研制的转基因玉米 NK603 基体标准物质适用于转基因玉米 NK603 的定量检测。     

中国稻谷干燥现状和稻谷干燥设备的开发

介绍了我国稻谷干燥技术和干燥设备的现状,重点探讨了稻谷干燥的特点,如低温、大风量和干燥后必须缓苏等。对稻谷干燥中的爆腰问题作了深入的分析,对影响稻谷品质的主要因素如干燥速率、缓苏时间和爆腰率的测定时间和方法进行了讨论。对进一步发展我国的稻谷干燥技术提出了建议。