家蚕保幼激素信号途径中转录因子BmKr-h1的基因克隆与表达分析

Krüppel homolog 1(Kr-h1)是含有C2H2锌指结构的转录因子,在昆虫变态发育中起重要作用。从家蚕5龄第3天幼虫的表皮中克隆了Bm Kr-h1基因,该基因全长c DNA为1 918 bp,其中开放阅读框1 047 bp,GC含量42.2%,编码348个氨基酸。氨基酸序列比对分析发现大部分昆虫物种的Kr-h1都含有8个锌指结构,暗示该蛋白质的功能具有一定的保守性。通过生物信息学方法预测Bm Kr-h1不含信号肽和糖基化位点,但含有19个可能的磷酸化位点,暗示其活性可能受到磷酸化和去磷酸化修饰的影响。利用原核表达系统表达获得了可溶的Bm Kr-h1蛋白并制备了抗体。Western blot和半定量RT-PCR检测的结果显示,不论在mRNA水平还是蛋白质水平,Bm Kr-h1在家蚕幼虫5龄初期和吐丝期的翅原基都有较高水平表达,而在蛹期的表达量较低。用保幼激素(JH)类似物Methoprene和蜕皮激素(20E)分别注射家蚕5龄第3天幼虫,发现2种激素均能诱导蚕体内Bm Kr-h1的表达上调。免疫组织化学结果显示,Bm Kr-h1在5龄第3天幼虫各组织中的表达量很低,而在吐丝期的中肠、脂肪体和表皮中都有一定水平的表达,暗示其可能参与家蚕蜕皮变态的过程。上述结果表明Bm Kr-h1可以响应JH和20E的诱导,提示其在家蚕的变态发育中发挥作用。     

家蚕胸腺素对蚕体抗核型多角体病毒感染能力的影响

胸腺素(THY)在动物进化过程中高度保守,并在许多生命活动中发挥重要作用。将家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)感染家蚕5龄幼虫后,分别提取蚕体及不同组织的RNA和蛋白质,检测Bm THY基因的转录及蛋白质表达的变化,并探究利用重组胸腺素r Bm THY增强家蚕抗病毒能力的可行性。qRT-PCR检测结果表明,感染Bm NPV后的家蚕5龄幼虫,其血淋巴、脂肪体、丝腺和气管中的Bm THY基因mRNA转录水平不同程度上调,而马氏管、中肠和头部组织中Bm THY基因mRNA转录水平则呈下调趋势;Western blotting检测家蚕5龄幼虫感染Bm NPV后72 h,蚕体内Bm THY蛋白的表达水平下降42.3%。家蚕5龄幼虫接种Bm NPV后,分别添食质量浓度为340μg/m L(高剂量)、34μg/m L(中剂量)和3.4μg/m L(低剂量)的r Bm THY溶液,调查3组幼虫的发病率为43.8%、54.0%和57.6%,而对照组幼虫分发病率为62.2%。研究结果初步证明Bm NPV感染可降低蚕体及部分组织中Bm THY的基因转录与蛋白质表达水平,高剂量r Bm THY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗Bm NPV病毒感染的能力。     

家蚕蜕皮激素22激酶2(BmEcK2)的序列及基因表达特征分析

前期研究发现在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,Bm CPV)的家蚕幼虫中肠中,有一个下调表达的差异蛋白可能参与了家蚕对Bm CPV感染的抵抗过程。利用Blastp进行同源性比对的结果显示,该蛋白质与尺蠖(Operophtera brumata)的未知蛋白质OBRU01_04785和蜕皮激素22激酶(Ecdysteroid 22-kinase)的序列相似度分别为51%、49%,进一步通过多序列比对和系统进化分析发现该蛋白质与Ecdysteroid 22-kinase蛋白的亲缘关系最近,属于蜕皮激素激酶超家族;该蛋白质与家蚕中已知的蜕皮激素22激酶1(Bm Ec K1)的序列相似度为24.4%,因此将其命名为Bm Ec K2。实时荧光定量PCR检测Bm Ec K2基因m RNA在家蚕5龄幼虫中肠组织中的转录水平最高,其次是马氏管、丝腺和卵巢,而在血淋巴、头部、精巢、脂肪体中几乎检测不到转录;家蚕5龄起蚕感染Bm CPV后24、48、72 h,中肠中Bm Ec K2基因m RNA的转录水平下调,分别是对照组家蚕中肠的0.32、0.45和0.21倍。研究结果初步提示,Bm CPV感染导致家蚕中肠中的Bm Ec K2下调表达,进而可能影响到家蚕体内激素调节水平的变化。     

家蚕Met1基因的表达与组织定位分析

选择家蚕基因组中与果蝇Dm Met(Methoprene tolerant protein)同源的基因Bm Met1进行研究。预测Dm Met和Bm Met1的结构域均是一个b HLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-ARNT-SIM)型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。在原核系统表达获得了Bm Met1蛋白并制备了抗体。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,无论是Bm Met1基因mRNA的转录还是Bm Met1蛋白的表达,在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中都呈现较高水平,而在蛹期呈现较低的水平。通过免疫组织化学方法分析Bm Met1的组织定位,结果显示该蛋白质在5龄第6天和吐丝期家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高水平的表达,在蛹期上述部位和组织的表达水平较低。分别将蜕皮激素(20E)和保幼激素类似物(Methoprene)按照2μg/头的剂量注射到5龄第3天幼虫第2~3胸节间,qRT-PCR检测幼虫翅原基组织中的Bm Met1受到Methoprene的诱导上调表达,且在处理2 h后表达水平最高。上述结果暗示Bm Met1可能参与了保幼激素对家蚕翅原基生长分化的调控。     

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。     

家蚕热激蛋白HSP90的鉴定、进化与表达模式

热激蛋白90是一类广泛分布与各类生物体中、高度保守的分子伴侣。HSP90s具有帮助受损蛋白的转运、折叠,防止聚集并恢复其正常构象等功能。昆虫HSP90s与生长发育、滞育和杀虫剂抗性等均相关。本研究在全基因组水平对家蚕HSP90s进行了鉴定,共分析获得3个基因(BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241)。根据系统发生分析,对家蚕HSP90s分别命名为Bm HSP90A1、Bm HSP90B1和Bm Trap1,它们分属于3个亚家族。家蚕与黑腹果蝇HSP90s直系同源基因的蛋白序列一致性均在60%以上。与其他物种HSP90s一样,家蚕HSP90s含有N-端ATPase结构域,4个特征性序列。基于组织和发育时期芯片及表达序列标签,发现家蚕HSP90s基因均有表达。基于芯片数据,Bm HSP90A1在雌雄间具有非常相似的表达模式,而Bm Trap1在5龄幼虫精巢中的信号值高达16 082.5,暗示着该基因可能与精巢发育相关。HSP90s作为一类功能广泛的分子伴侣,本研究将为其功能研究奠定基础。     

家蚕热激蛋白HSP90的鉴定、进化与表达模式

热激蛋白90是一类广泛分布与各类生物体中、高度保守的分子伴侣。HSP90s具有帮助受损蛋白的转运、折叠,防止聚集并恢复其正常构象等功能。昆虫HSP90s与生长发育、滞育和杀虫剂抗性等均相关。本研究在全基因组水平对家蚕HSP90s进行了鉴定,共分析获得3个基因(BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241)。根据系统发生分析,对家蚕HSP90s分别命名为Bm HSP90A1、Bm HSP90B1和Bm Trap1,它们分属于3个亚家族。家蚕与黑腹果蝇HSP90s直系同源基因的蛋白序列一致性均在60%以上。与其他物种HSP90s一样,家蚕HSP90s含有N-端ATPase结构域,4个特征性序列。基于组织和发育时期芯片及表达序列标签,发现家蚕HSP90s基因均有表达。基于芯片数据,Bm HSP90A1在雌雄间具有非常相似的表达模式,而Bm Trap1在5龄幼虫精巢中的信号值高达16 082.5,暗示着该基因可能与精巢发育相关。HSP90s作为一类功能广泛的分子伴侣,本研究将为其功能研究奠定基础。     

家蚕一种富含半胱氨酸蛋白基因BmCRP的原核表达与定位研究

从家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经生物信息学分析显示该cDNA序列全长1 011 bp,包括5′-UTR 200 bp和3-′UTR 136 bp,编码224个氨基酸,其编码蛋白质的N-端富含半胱氨酸,将该基因命名为BmCRP(基因登录号:DN985186.1)。该基因编码蛋白主要有α螺旋、β-折叠、无规则卷曲3种二级结构,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点等5种功能位点。构建重组表达载体pET-28 a(+)-BmCRP并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得融合蛋白,用纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体与BmCRP有较好的特异性。W estern b lotting检测结果:BmCRP蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在5龄幼虫的表皮、头部、卵巢、睾丸、马氏管中均有表达。荧光定量RT-PCR检测结果:BmCRPmRNA在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾的整个生命周期中,其转录水平呈增加趋势;在5龄幼虫不同组织中的转录水平从高到低依次为表皮、头部、生殖腺、中肠、马氏管、气管、丝腺和脂肪体。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均存在,细胞核中的荧光信号比细胞质中的信号强。研究结果有助于进一步探明家蚕BmCRP蛋白的结构和功能。     

家蚕模式识别受体PGRP、βGRP编码基因的克隆鉴定及表达谱分析

模式识别受体(PRR)是生物体先天免疫系统中免疫受体的代表,对生物体的生存极为重要。克隆鉴定了家蚕的14个模式识别受体编码基因,包括10个肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因和4个β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)基因,并得到了BmPGRP-S3、BmPGRP-S4和BmPGRP-L5的完整编码序列。家蚕PGRP的长型和短型亚家族都具有典型的酰胺酶活性结构域,短型亚家族具有信号肽,长型亚家族则没有信号肽。5个PGRP长型亚家族基因成簇分布于第1号染色体;5个PGRP短型亚家族基因中有2个分布于第9号染色体,有3个分布于第16号染色体。家蚕βGRP家族成员都具有信号肽,其中BmβGRP1-3成簇分布于第11号染色体,编码蛋白不具有典型的葡聚糖结合结构域;BmβGRP4独立分布于第22号染色体,编码蛋白具有典型的葡聚糖结合结构域。基因芯片数据分析表明,BmPGRP-L5和BmβGRP1在5龄第3天幼虫各组织中没有表达,其余12个模式识别受体基因为多组织表达,但在丝腺组织中均无表达。在这12个模式识别受体基因中,BmPGRP-L3等6个模式识别受体基因在中肠组织中的表达水平偏高;BmβGRP3、BmβGRP4和BmPGRP-L3、BmPGRP-L4等在家蚕生殖腺中的表达水平较高。在生殖腺以外的其他各组织中,这12个基因的表达不具有雌雄差异性。BmβGRP1在家蚕各发育时期没有表达,BmPGRP-L5主要在变态发育的转折期表达,其余12个模式识别受体基因在各发育时期均有表达,并从5龄第3天幼虫到上蔟第2天有较高水平的表达,雌雄个体间无表达差异性。由此说明这些模式识别受体基因的表达具有一定的组织性和发育时期性。给人工饲料无菌饲养的家蚕5龄第3天幼虫分别添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导3、6、12和24h的家蚕进行个体水平的实时荧光定量PCR检测,发现PGRP长型亚家族基因BmPGRP-L1、BmPGRP-L3和短型亚家族基因BmPGRP-S1-3均能被这3种微生物诱导上调表达;βGRP基因家族中的BmβGRP3、BmβGRP4也能被3种微生物诱导上调表达。同时对诱导12h时家蚕各组织中14个家蚕模式识别受体基因的表达谱进行分析,结果显示经3种微生物分别诱导后,家蚕头部组织中BmβGRP2、BmβGRP4、BmPGRP-L2和BmPGRP-S1、BmPGRP-S3-5均上调表达;表皮、中肠和脂肪体中仅有BmβGRP3、BmPGRP-L4等少数模式识别受体基因上调表达。     

化学感受蛋白家族基因在家蚕5龄幼虫表皮中的表达分析

化学感受蛋白(chemosensory protein,CSPs)在昆虫的免疫反应、生长发育及信号传递过程中起重要作用。以耐高温家蚕品种为材料,研究高温饲养环境下,作为家蚕物理屏障及感觉器官的表皮中化学感受蛋白基因的表达变化。依据从家蚕基因组数据库获得的15个家蚕CSPs基因(Bm CSPs)的序列设计引物,通过RT-PCR检测正常饲育温度(28℃±0.5℃)下,Bm CSP1、Bm CSP4、Bm CSP6、Bm CSP7、Bm CSP8、Bm CSP9、Bm CSP11和Bm CSP15等8个基因在家蚕5龄第2天幼虫的表皮中有表达;通过半定量RT-PCR和qRT-PCR检测在高温(35℃±0.5℃)饲育环境下,5龄第2天幼虫表皮中Bm CSP8和Bm CSP15的表达水平显著上调,其他6个Bm CSPs基因的表达水平未见显著变化。初步推测Bm CSP8和Bm CSP15可能与家蚕幼虫对高温环境的应激反应有关。     

家蚕C型凝集素16基因(BmCTL 16)的电子克隆及序列特征和表达谱

C型凝集素是在动物先天免疫中发挥重要作用的模式识别受体。从家蚕杂交一代超亲表达的基因中筛选出一个C型凝集素16基因(Bm CTL 16),通过电子克隆、序列拼接获得了总长度为1 105 bp的序列,其5'端和3'端分别为63 bp、385 bp,预测ORF为657 bp,在3'端终止密码子下游314 bp位置为加尾信号胞质多聚腺苷化特异因子(CPSF)结合位点。预测Bm CTL16编码218个氨基酸,组成蛋白质的氨基酸有20种,数量最多的是亮氨酸(有19个),蛋白质理论等电点(p I)6.65,分子质量25.124 4 k D。Scan Prosite结构域预测Bm CTL 16存在与其它鳞翅目昆虫CTL一样保守的糖蛋白识别位点CRD。系统进化分析表明Bm CTL 16与烟芽夜蛾、小菜蛾、刺舌蝇、埃及伊蚊的同源CTL序列相似度均高达99%。对电子拼接序列进行RT-PCR验证,扩增片段的测序结果与电子克隆的Bm CTL 16序列完全一致。qRT-PCR分析Bm CTL 16在5龄第1~2天幼虫中肠组织中的表达量较高,之后呈现下降趋势,推测可能是家蚕5龄初期旺盛的生命活动提高了蚕体免疫功能。     

家蚕脂蛋白基因BmLp-c21的表达分析及蛋白质亚细胞定位

家蚕30 kD脂蛋白家族在家蚕的生长发育过程中具有重要的生理功能。从家蚕蛹cDNA文库中克隆到一条编码30kD蛋白质的基因cDNA序列,该序列全长2 803 bp,ORF为792 bp,编码含263个氨基酸残基的脂蛋白(low molecular 30K lipo-protein pBmHPC-21;GenBank登录号:Q00801),命名为BmLp-c21。将BmLp-c21克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达后通过亲和层析得到纯化的融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。亚细胞定位显示BmLp-c21主要存在于细胞质中,呈点状或者片状分布。通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测到家蚕不同发育时期和5龄幼虫不同组织中BmLp-c21 mRNA的转录水平与蛋白质的表达水平存在较大差异,在蛹期及5龄幼虫血淋巴中的mRNA转录水平和蛋白质表达水平最高。初步推测BmLp-c21在家蚕蛹的变态发育过程以及蚕体脂质的运输方面具有重要的功能。     

家蚕金属羧肽酶基因家族的鉴定与表达分析

金属羧肽酶是昆虫消化管中参与食物消化吸收的重要酶类,并可能在昆虫变态、发育、抗病免疫等多种生命过程中发挥重要作用。利用家蚕全基因组数据库,基于同源搜索和隐马尔可夫模型搜索相结合的方法,对家蚕金属羧肽酶基因家族进行鉴定。全基因组预测家蚕的金属羧肽酶基因家族包括22个成员,推导的氨基酸序列均具有锌离子结合位点和金属羧肽酶M14的保守特征。根据其保守氨基酸序列不同,家蚕的金属羧肽酶分属于M14A、M14B和M14D 3个亚家族。通过RTPCR方法检测显示22个家蚕金属羧肽酶基因中有18个基因在家蚕不同组织和发育时期中表达,其中7个基因在家蚕5龄第3天幼虫中肠组织特异高量表达,提示金属羧肽酶在家蚕对营养物质的消化吸收中有重要作用;家蚕5龄幼虫添食感染Bm NPV后24 h内,中肠中有5个金属羧肽酶基因上调表达,表现出对病原微生物侵染的应答反应。研究结果有助于解析家蚕金属羧肽酶在蚕体对营养物质的消化和对病原物入侵应答中的功能作用。     

家蚕多梳蛋白家族基因BmPsc的全长序列克隆及表达分析

多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基因的功能。Bmi-1在昆虫中的同源基因为Psc(posterior sex combs)。采用RACE技术获得家蚕Psc基因(BmPsc)全长4 084 bp的序列。该基因位于家蚕第4号染色体上,是一个单外显子基因,ORF为3 291 bp,编码1 096个氨基酸,蛋白质分子质量121 kD,等电点(pI)为9.83;同源序列比对发现BmPsc与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的Psc基因序列有58%的相似度,与果蝇(Drosophila melanogaster)的Psc基因序列仅有34%的相似度;氨基酸序列分析显示BmPsc具有保守的N端Ring结构。利用qRT-PCR检测家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄各时期幼虫血液中BmPsc基因的表达水平,发现BmPsc在各组织均有表达,在精巢以及卵巢中的表达明显较高,其次是翅原基(含造血器官),在循环血液中也有较高表达;在5龄各时期幼虫血液中的表达呈一定规律性,于蜕皮后的5龄第2天以及进入变态前的5龄第6天出现表达峰值,而在5龄中期(第4～5天)为表达低谷。研究结果为进一步阐释该基因在细胞水平以及个体水平对干细胞分化的抑制作用奠定了基础。     

家蚕翅原基发育关联基因BmHMGS的鉴定与表达特征分析

家蚕幼虫的翅原基最终发育为成虫的翅,翅原基发育与家蚕的变态发育紧密关联。为了研究激素作用下家蚕翅原基发育的分子调控机制,以经过蜕皮激素20E体外诱导培养和未经诱导培养的家蚕5龄幼虫翅原基为材料分别提取总蛋白质,利用Shotgun质谱分析在20E诱导组的翅原基中获得132种差异蛋白,在未经20E诱导组的翅原基中获得76种差异蛋白。进一步通过生物信息学技术及GO分类法在20E诱导组的翅原基的差异蛋白中,筛选到1个具有生物调节作用的酶类蛋白基因Bm HMGS作为翅原基发育相关的候选基因,设计引物并以上蔟1 d的蚕体翅原基总RNA反转录得到的c DNA为模板,克隆了该基因。通过qRT-PCR检测到Bm HMGS基因在幼虫5龄1 d、上蔟3 d、蛹期1 d蚕体内的表达量较高,其中在上蔟3 d的表达量达到峰值。构建重组载体进行Bm HMGS的原核表达并制备抗体后,采用Western blot技术在5龄1~7 d和上蔟1~3 d的蚕体翅原基、脂肪体中及上蔟1~3 d的生殖腺中都可以检测到Bm HMGS的表达,并且在翅原基中的表达没有发育时期特异性。研究结果表明,从20E诱导组的家蚕翅原基中鉴定的Bm HMGS与翅原基发育相关,其表达在5龄至上蔟阶段没有时期和组织的特异性,推测Bm HMGS是一个具有多种生物学功能的基因。     

家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。     

家蚕转录因子AP-4基因cDNA的分子克隆与生物信息学分析

AP-4(activator protein 4)是一种转录因子,在生物的生长发育中有重要作用。根据家蚕表达序列标签(EST)并利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了家蚕AP-4(Bombyx mori activator protein4)基因,结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,预测了AP-4蛋白的理化性质。获得的家蚕AP-4基因cDNA的全长为1621bp,其开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,基因由3个外显子和2个内含子组成。同源性比对表明该基因推导的氨基酸序列与棉铃虫AP-4和谷蛀虫AP-4推测的蛋白同源性分别为76%和54%,第45-99位氨基酸序列是一个典型的保守结构域。实时定量RT-PCR显示该基因在所检测家蚕的各发育时期中,除幼虫1龄和蛹期第4天无表达外,其它时期均有表达,其中幼虫3龄和4龄期的表达量较高。     

家蚕含RRM保守结构域蛋白基因(Bmrrm)的克隆及序列分析与表达研究

RRM(RNA recognition motif)是RNA结合蛋白中广泛存在的一种保守结构域。从构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条含有RRM保守结构域的cDNA,命名为Bmrrm(GenBank登录号:DQ534196)。Bmrrm基因全长1086 bp,开放阅读框大小为894 bp,编码297个氨基酸残基,蛋白理论分子质量33.2 kD,等电点9.69,预测的三级结构由2个α螺旋和4个β折叠组成。将该基因的PCR扩增产物于原核表达载体pET-28a(+)中表达后经SDS-PAGE检测,在36 kD处的特异性蛋白条带与预期值相符,重组蛋白以可溶的形式表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价大于1∶6400。采用荧光定量PCR方法对家蚕卵、5龄幼虫、蛹、蛾4个发育时期以及5龄幼虫各组织中Bmrrm的mRNA转录水平进行检测比较,发现在蛹期和5龄幼虫生殖腺、表皮中的转录水平较高。采用免疫印迹方法在家蚕的卵期、5龄幼虫、蛹期,以及5龄幼虫的生殖腺、表皮、脂肪体中检测到BmRRM蛋白有明显表达,但在蛾期及5龄幼虫的其他组织中未检测到该蛋白。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,BmRRM蛋白在整个细胞周期主要分布于细胞核,仅少量分布于细胞质。初步推测BmRRM蛋白参与蚕体内RNA前体的剪接、细胞定位及维持稳定等转录后调控过程。     

家蚕BmE(spl)-like基因的克隆与表达谱分析

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条新的cDNA序列,生物信息学分析发现其编码的蛋白质序列与果蝇Enhancer of split基因[E(spl)]编码的DNA结合转录调控因子bHLH(helix-loop-helix)有较高的同源性,将该基因命名为BmE(spl)-like(Bombyx mori Enhancer of split like)。该基因的ORF长606 bp,编码201个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量22.3 kD,等电点9.7。构建重组表达质粒pET-28a-BmE(spl)-like并在E.coli BL21(DE3)菌株中表达BmE(spl)-like蛋白,经亲和层析和FPLC反向柱纯化融合蛋白His-BmE(spl)-like并制备了抗体效价1∶25 600以上的多克隆抗体。用qRT-PCR方法检测BmE(spl)-like在家蚕成虫发育期的转录水平最高,结合果蝇同源基因的功能,推测该基因与蚕蛾的翅发育相关;该基因在家蚕5龄幼虫各组织中的转录水平以表皮最高,马氏管中最低。Western blotting检测BmE(spl)-like在家蚕5龄幼虫性腺中的表达水平最高,其次是丝腺、表皮、脂肪体、肠组织,在头部、马氏管和气管中的表达水平极低,与qRT-PCR检测的BmE(spl)-like在各组织中的转录水平有些差异。     

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。