家蚕丝腺因子SGF-1的基因克隆及序列结构和表达特征与亚细胞定位

Fox类转录因子在细胞生长、增殖、分化和胚胎发育等过程中发挥重要功能,SGF-1是家蚕丝腺细胞转录因子,属于Fox类转录因子家族。家蚕SGF-1(BGIBMGA005101-TA)基因位于第25号染色体nscaf2823:112743~113792(+strand),含有1个外显子,CDS全长1 050 bp,编码349个氨基酸。家蚕品种大造5龄第3天幼虫的基因芯片表达谱显示,SGF-1基因在大多数组织中有表达,在丝腺中高量表达,其中在前部和中部丝腺的表达量略高于后部丝腺,在雄蚕中的表达量略高于雌蚕。氨基酸组成分析显示,SGF-1蛋白富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸,且多数为亲水性氨基酸。序列结构分析表明,SGF-1包含典型的Forkhead结构域,其两端分别为Forkhead_N末端结构域和HNF3_C末端结构域,其中大多数氨基酸残基形成了无规则卷曲结构,α-螺旋与β-折叠结构分别约占18.0%和0.6%。从家蚕后部丝腺克隆了SGF-1基因,并构建麦芽糖结合蛋白标签融合表达载体,表达并纯化了重组SGF-1蛋白。通过RT-PCR与Western blotting检测分别从基因转录水平和蛋白质表达水平上证实,SGF-1在家蚕5龄第3天幼虫丝腺中高量表达。亚细胞定位实验显示SGF-1定位于细胞核中。这些结果为深入研究SGF-1的结构和功能提供了有益的基础信息。     

家蚕Met1基因的表达与组织定位分析

选择家蚕基因组中与果蝇Dm Met(Methoprene tolerant protein)同源的基因Bm Met1进行研究。预测Dm Met和Bm Met1的结构域均是一个b HLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-ARNT-SIM)型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。在原核系统表达获得了Bm Met1蛋白并制备了抗体。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,无论是Bm Met1基因mRNA的转录还是Bm Met1蛋白的表达,在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中都呈现较高水平,而在蛹期呈现较低的水平。通过免疫组织化学方法分析Bm Met1的组织定位,结果显示该蛋白质在5龄第6天和吐丝期家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高水平的表达,在蛹期上述部位和组织的表达水平较低。分别将蜕皮激素(20E)和保幼激素类似物(Methoprene)按照2μg/头的剂量注射到5龄第3天幼虫第2~3胸节间,qRT-PCR检测幼虫翅原基组织中的Bm Met1受到Methoprene的诱导上调表达,且在处理2 h后表达水平最高。上述结果暗示Bm Met1可能参与了保幼激素对家蚕翅原基生长分化的调控。     

家蚕转录因子AP-4基因cDNA的分子克隆与生物信息学分析

AP-4(activator protein 4)是一种转录因子,在生物的生长发育中有重要作用。根据家蚕表达序列标签(EST)并利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了家蚕AP-4(Bombyx mori activator protein4)基因,结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,预测了AP-4蛋白的理化性质。获得的家蚕AP-4基因cDNA的全长为1621bp,其开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,基因由3个外显子和2个内含子组成。同源性比对表明该基因推导的氨基酸序列与棉铃虫AP-4和谷蛀虫AP-4推测的蛋白同源性分别为76%和54%,第45-99位氨基酸序列是一个典型的保守结构域。实时定量RT-PCR显示该基因在所检测家蚕的各发育时期中,除幼虫1龄和蛹期第4天无表达外,其它时期均有表达,其中幼虫3龄和4龄期的表达量较高。     

昆虫保幼激素和蜕皮激素对家蚕丝腺生长的影响

外源性JHA和MH对家蚕丝腺生长的影响,因蚕儿的发育时期及使用剂量不同而异;在5龄前期,JHA抑制丝腺生长,MH促进生长;而在5龄后期,JHA的促进作用大于MH;若进行激素连续处理或一次性高剂量注射,则两种激素均具有强烈的抑制作用。     

Balb/c小鼠线粒体转录终止因子3基因克隆及其组织表达分析

旨在获得Balb/c小鼠线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因cDNA的序列特征并进行比较分析,揭示该基因的组织特异性表达规律。应用RT-PCR技术克隆Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA编码区序列(CDS),采用MEGA6.0软件构建小鼠MTERF3基因系统进化树,并采用Northern blot、RT-qPCR和Western blot技术研究该基因在小鼠大脑、心、脾、肺、肾、肝、骨骼肌和睾丸等8种不同组织中的特异性表达规律。结果显示,Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA的CDS序列大小为1239bp,编码412个氨基酸。小鼠MTERF3基因与大鼠MTERF3基因同源性高达91.1%。MTERF3基因mRNA和蛋白质在Balb/c小鼠各组织中均有不同程度的表达。结果表明,成功克隆了Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA的完整编码区序列,并揭示了该基因在各组织器官的表达规律,为进一步研究MTERF3基因在实验动物体内的功能奠定了基础。     

转录组分析揭示热激诱导家蚕孤雌生殖发生相关的信号通路

为了筛选热激诱导家蚕非减数分裂孤雌生殖(ameiotic parthenogenesis)发生相关的基因和关键信号通路,应用Illumina HiSeq X Ten平台对具有高发生率和高孵化率的孤雌生殖系与低发生率和低孵化率的两性生殖系亲本在热激诱导前后的未受精卵进行转录组测序和比较分析。热激诱导前后分别鉴定到差异表达基因4 477与6 196个。热激诱导前差异表达基因主要涉及卵子发生、绒毛膜、卵壳形成等过程,暗示热激前孤雌生殖系和两性生殖系在发育水平上存在差异。热激诱导后差异表达基因主要富集在膜组成部分,参与信号转导通路的差异表达基因最多,主要富集在cAMP、PI3K-Akt、MAPK、Ras等信号通路,这些通路与热激响应和减数分裂有关,推测热激可能通过cAMP等信号通路调控减数分裂过程参与孤雌生殖的发生。本研究有助于进一步探索复杂的孤雌生殖诱导发生机制。     

家蚕翅原基表皮蛋白基因BmWCPs的生物信息学分析与激素诱导表达特征

翅原基表皮蛋白(WCPs)在昆虫翅的发育中起着非常重要的作用。为了研究家蚕翅原基表皮蛋白基因BmW CPs的表达是否与蜕皮激素(20E)的调节有关,用生物信息学方法分析BmW CPs基因的序列结构与系统进化特点,并通过半定量RT-PCR检测蜕皮激素对部分BmW CPs基因表达的诱导作用。11个BmW CPs基因成簇分布在家蚕基因组中,除BmW CP6和BmW CP10分别分布在第7号、第21号染色体外,其余的BmW CPs均分布在第22号染色体上;11个BmW CPs的核苷酸序列长度为588~2 670 bp,编码115~312个氨基酸,蛋白质分子质量12~35 kD,等电点4.30~7.45;11个BmW CPs基因的ORF内均有内含子插入,81.82%的基因含有2~3个内含子,内含子长度50~5 958 bp,在50~300 bp之间分布频率最高,占46%。将解剖获取的上蔟1 d蚕体的翅原基进行体外培养,并用浓度为2μmol/L的20E直接处理12 h后再常规培养18 h,提取翅原基总RNA并反转录合成cD NA,经半定量RT-PCR检测样品中BmW CPs的表达水平显著上调。依据上述研究结果初步认为,用蜕皮激素直接处理12 h后再常规培养18 h的脉冲作用,可诱导基因组中成簇分布的BmW CPs在翅原基组织中大量表达,以利于家蚕完成翅原基的变态发育。     

蒙农杂种冰草AcdMYB1基因克隆及表达分析

‘蒙农杂种’冰草(Agropyron cristatum×A.desertorum‘Hycrest-Mengnong’)具有干草产量高,适口性好,抗逆性强的特点,是中国北方干旱地区建立人工草地的适宜草种。本研究利用同源克隆方法从‘蒙农杂种’冰草中克隆得到的1个MYB类转录因子基因(命名为AcdMYB1),对其进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明：该基因cDNA序列长度为1 161 bp,包含完整开放阅读框(ORF)为969 bp,编码322个氨基酸,具有MYB转录因子的保守结构域。AcdMYB1与小麦族的山羊草、普通小麦、野生二粒小麦的同类基因亲缘关系最近,序列一致性均在90%以上。组织表达中AcdMYB1基因在穗中的表达量最高,其次为叶、根,茎中表达量最低;在模拟自然干旱胁迫下,能够显著降低AcdMYB1的表达水平。烟草亚细胞定位显示,该蛋白定位于细胞核。本研究为进一步探索‘蒙农杂种’冰草AcdMYB1基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。     

家蚕尿酸氧化酶基因BmUo的克隆及其序列分析与原核表达

尿酸氧化酶(urate oxidase;EC1.7.3.3)能够降解尿酸形成尿囊素,在嘌呤代谢途径中起到至关重要的作用。用生物信息学方法在家蚕基因组数据库中进行同源性检索,获得一条可能的家蚕尿酸氧化酶序列,根据预测序列设计引物及克隆、测序验证,已成功地克隆到家蚕尿酸氧化酶基因BmUo的完整ORF。克隆的cDNA(GenBank登录号:DQ189992)全长1088bp,ORF长1014bp,编码337个氨基酸残基,预测分子质量为38.18kD,等电点为6.90。通过半定量RT-PCR检测了该基因在各组织的表达情况,发现该基因的mRNA在5龄第3天的家蚕的脂肪体和马氏管中有表达。该基因在氨基酸水平上与果蝇、按蚊尿酸氧化酶的相似性分别为45.6%和51%,在第91个氨基酸残基处具有Asn-Ser-X-Val/Ile-Val/Ile-Ala/Pro-Thr-Asp-Ser/Thr-X-Lys-Asn的高度保守序列,这一序列在真核生物和原核生物中均广泛存在,可能与尿酸氧化酶的酶活性有关。家蚕尿酸氧化酶与其他38个物种尿酸氧化酶的聚类分析发现,尿酸氧化酶基因在昆虫、真菌、双子叶植物和哺乳动物这一层面上是相对保守的。将BmUo基因片段与pET-28a连接,构建原核表达载体pET-28a/uo,重组载体转化大肠杆菌BL21后,在37℃的培养条件下可检测到与理论分子质量相符的蛋白条带。     

家蚕模式识别受体βGRP4的序列分析及诱导表达

β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)属于模式识别受体(PRR),很多无脊椎动物的βGRP具有结合β-1,3-葡聚糖的能力,在识别入侵病原物和激活免疫调控途径中起着重要作用。对克隆的家蚕βGRP4(BmβGRP4,GenBank登录号为:GQ372969)及编码蛋白进行序列分析和诱导表达,探讨其参与免疫应答的作用方式。BmβGRP4的开放阅读框(ORF)长1 128 bp,编码375个氨基酸,具有一个由17个氨基酸组成的信号肽,预测成熟体蛋白分子质量为40.3 kD,等电点为6.5。BmβGRP4含有一个糖苷水解酶活性结构域(Glyco_hydro_16),具有结合β-1,3-葡聚糖的能力。将BmβGRP4亚克隆到p28载体进行原核表达,获得带有His标签的重组蛋白。给家蚕5龄第3天幼虫分别以1×109个/头的剂量添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导18 h后家蚕体内的BmβGRP4表达水平进行Western blotting分析,结果表明BmβGRP4能被上述3种微生物诱导而产生较强的表达活性。研究结果提示BmβGRP4可能在家蚕先天免疫应答反应中通过识别病原微生物表面的相关分子模式而发挥作用。     

家蚕滞育性卵胚胎发育过程中蜕皮激素和保幼激素含量的变化

测定发现,家蚕滞育卵胚胎发育全过程中,蜕皮激素和保幼激素含量的变化辐度较大,保幼激素含量与胚胎发育进程的关系密切,保幼激素含量又与蜕皮激素含量有关。因此认为,虽然蜕皮激素和保幼激素对胚胎滞育性没有决定作用,但蜕皮激素和保幼激素相互拮抗又相互协调,对滞育激素控制的胚胎发育进程起某种调节作用。     

家蚕细胞周期素家族基因的克隆及结构特征与表达分析

细胞周期素(cyclin)是推进细胞周期进程最主要的调控因子之一,并与个体发育及肿瘤形成等有关。为研究细胞周期素家族基因在家蚕组织中的表达情况,利用家蚕基因组数据库信息设计引物克隆了家蚕细胞周期素家族的5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,cyclinA、cyclinB、cyclinB3基因分别有7个外显子,cyclinE基因有8个外显子,cyclinL1基因只有1个外显子;cyclinA及cyclinE基因存在较多的剪切方式,cyclinA主要包含大小为2 141和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7外显子,cyclinE则含有1 422、1 290及1 194 bp等大小不同的序列,变化集中于第5～7外显子,而cyclinB、cyclinB3及cyclinL1基因则相对稳定。克隆的家蚕细胞周期素家族基因的组织表达存在差异:cyclinA基因只在精巢中表达,cyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,cyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,cyclinB和cy-clinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究不同细胞周期素在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。     

家蚕丝氨酸蛋白酶BmHP14基因的克隆与表达模式分析

家蚕受到外源微生物侵染或损伤时,前酚氧化酶原级联反应中的起始丝氨酸蛋白酶会激活下游信号通路,最终产生黑色素。采用RACE技术,获得了家蚕前酚氧化酶原级联反应起始丝氨酸蛋白酶——血淋巴蛋白酶编码基因的全长cDNA序列,命名为BmHP14(GenBank登录号:JQ954757)。BmHP14 cDNA全长2 508 bp,开放阅读框为2 013 bp,编码670个氨基酸,预测蛋白质分子质量71 kD,等电点5.09,N端17个氨基酸预测为信号肽序列。多重序列比对显示BmHP14与烟草天蛾HP14的相似度很高,达到57%;分子进化树中二者也聚为一支。RT-PCR分析表明,BmHP14在家蚕5龄第3天幼虫脂肪体、马氏管、精巢、卵巢、表皮、血细胞、头部均有表达,其中以脂肪体中的表达水平最高。以黑胸败血芽孢杆菌、大肠杆菌、球孢白僵菌注射侵染家蚕5龄第3天幼虫,Real-time PCR检测显示在受到病菌侵染后,幼虫脂肪体中的BmHP14表达上调。Westernblotting检测结果显示,BmHP14在家蚕体液中以前体和成熟体的形式共同存在。研究结果提示,BmHP14是家蚕前酚氧化酶原级联反应信号通路中的关键酶。     

猪激素敏感脂酶基因克隆与序列分析

从杜长大猪的肠系膜脂肪中提取基因组RNA,用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增激素敏感脂酶（HSL）基因,获得一条633 bp的片段,以pGEM-T Easy Vector为载体,将该基因片断克隆到大肠杆菌中,从筛选的阳性克隆中分离出HSL基因,测定其序列.结果表明：该基因片段长633 bp,为HSL基因cDNA的部分序列;序列同源性比较表明,该基因序列与GenBank登录的HSL基因（AY686758）有高达100%的同源性.     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达

脱水应答元件结合蛋白(DREB)在植物响应盐和干旱胁迫中发挥重要作用.为研究DREB在耐盐碱耐干旱的先锋植物四翅滨藜(Atriplex canescens)中的功能及其应用前景,本研究设计了一对简并引物,通过PCR扩增和RACE法克隆得到四翅滨藜DREB转录因子编码基因AcDREB2.该基因cDNA全长为867 bp,共编码242个氨基酸.序列BLAST比对与同源性分析结果表明,该基因与其他植物的DREB具有较高的同源性.利用RT-PCR方法进行表达模式分析发现,AcDREB2在四翅滨藜叶中高丰度表达,且其表达受NaCl和渗透胁迫处理的快速诱导,表明AcDREB2参与了四翅滨藜的抗逆响应.     

四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达

脱水应答元件结合蛋白(DREB)在植物响应盐和干旱胁迫中发挥重要作用。为研究DREB在耐盐碱耐干旱的先锋植物四翅滨藜(Atriplex canescens)中的功能及其应用前景,本研究设计了一对简并引物,通过PCR扩增和RACE法克隆得到四翅滨藜DREB转录因子编码基因AcDREB2。该基因cDNA全长为867 bp,共编码242个氨基酸。序列BLAST比对与同源性分析结果表明,该基因与其他植物的DREB具有较高的同源性。利用RT-PCR方法进行表达模式分析发现,AcDREB2在四翅滨藜叶中高丰度表达,且其表达受NaCl和渗透胁迫处理的快速诱导,表明AcDREB2参与了四翅滨藜的抗逆响应。     

一种家蚕胚胎发育因子的分子克隆及分析

利用表达序列标签（Expression sequence tag,EST）和电子克隆等技术,克隆家蚕BmEDF基因cDNA电子序列,经RT—PCR生物验证正确,登录GenBank（DQ443161）。BmEDF基因cDNA长1098bp,ORF全长810bp,编码产生269个氨基酸。BmEDF基因编码的蛋白分子量约为30．7kDa,等电点（PI）为9．16。本研究将对今后分子水平分析胚胎发育提供研究基础。     

家蚕追寄蝇孵化酶的基因克隆与特性分析

家蚕追寄蝇寄生于家蚕幼虫引起的蝇蛆病危害蚕业生产。为从分子水平研究家蚕追寄蝇的孵化机制,以发育1.5 d的蝇卵为材料,结合RACE技术获得家蚕追寄蝇孵化酶基因的全长cDNA,命名为EsHE(GenBank登录号：ON042475)。EsHE基因cDNA全长1 507 bp,包含159 bp 5′UTR、412 bp 3′UTR和936 bp的完整ORF,编码311个氨基酸;EsHE蛋白序列含有孵化酶特征序列HELMHVLGFMHE(锌结合基序)和YDYGSVMHY(Met-转角基序);系统进化树分析显示,家蚕追寄蝇与丝光绿蝇的孵化酶亲缘关系最近。qRT-PCR检测EsHE基因在家蚕追寄蝇卵期的表达模式,发现在卵产后36 h EsHE表达量开始大幅上升,至孵化前的48 h达到最高水平;且在3龄幼虫中肠组织高水平表达。这些结果暗示EsHE与家蚕追寄蝇的胚胎发育和孵化密切相关,还可能参与幼虫期的食物消化、蛋白质代谢等生物学过程。通过以家蚕追寄蝇基因组DNA为模板扩增发现,EsHE基因含有1个内含子(2 638 bp)和2个外显子(第1外显子1 005 bp,第2外显子502 bp),基因结构...     

家蚕核苷二磷酸激酶基因的克隆和原核表达

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在进化中高度保守,却又呈现复杂多样的生物学功能。该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。从家蚕蛹cDNA文库中获得家蚕核苷二磷酸激酶的cDNA序列,该cDNA序列长575bp,含465 bp的开放阅读框序列,编码154个氨基酸残基的核苷二磷酸激酶。将克隆的家蚕核苷二磷酸激酶基因插入pET-28 a构建重组质粒,转化大肠杆菌后诱导表达重组蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组家蚕核苷二磷酸激酶。