一种家蚕微孢子虫孢子快速染色鉴定的方法

家蚕微粒子病是唯一一种可经胚种传染给后代,造成家蚕毁灭性的传染性蚕病.为了防止微孢子虫的胚种传染,在蚕种制造过程中采用母蛾镜检法进行控制.为了更有效、精确地镜检母蛾,提高镜检的准确度与灵敏度,国内外有关学者进行了荧光抗体识别法、血清学凝集反应法、酶联免疫吸附法、单克隆抗体法、PCR法等检测方法探索研究.虽然这些方法检测家蚕微孢子虫具有灵敏度高、特异性强的优点,但因其检测条件要求较高的技术工艺,一般的母蛾质检部门不易达到,故多数还停留在实验室阶段.     

家蚕微孢子虫单克隆抗体的研制

以家蚕(Bombyx mori)微孢子虫(Nosema bombycis)免疫BALB/C小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后制备杂交瘤细胞,分泌对N.bombycis孢子表面抗原特异性的单克隆抗体。用酶联吸附免疫分析(ELISA)以筛选杂交瘤细胞,经3次有限稀释法克隆后,用包括N.bombycis等6种微孢子虫及正常蚕体组织匀浆作抗原筛选出1株分泌仅对N.bombycis孢子有特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(LC_2)。小鼠腹水滴度为1:640O,用ELISA最少检出100O个孢子的样本。     

家蚕病原性微孢子虫的超微结构研究

通过光学显微镜和电子显微镜对收集到的８ 种不同来源的对家蚕有病原性的微孢子虫的外部形态和超微结构进行了观察、比较,其结果：（１） 未见外部形态有特征性差异。（２） 超微结构既存在相似性,如孢子壁分层、极丝结构、固定板等;也存在相异性,尤其是极膜结构、后极泡的内部构造、极丝圈数与倾斜角、核糖体的数量及排列方式等方面差别较大。     

家蚕微孢子虫病研究进展

家蚕微孢子虫病是由微孢子虫Microsporidia(微粒子原虫类 )寄生蚕体引起的一种古老的、分布较广的传染性病害,因其经卵传染性而被世界各养蚕国家和地区列为蚕种生产的惟一检疫对象.多年来,广大学者对其病原、检测技术及防治方法等方面进行了大量的研究,取得了较大进展.现综述如下: 1 家蚕微孢子虫病病原的研究     

家蚕微孢子虫全基因组分析支持微孢子虫与真菌的亲缘关系

微孢子虫(microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,虽然分子生物学的研究证据表明其与真菌(fun-gi)存在亲缘关系,但这些证据均是基于单个或少数几个基因构建系统进化树而得出的。利用家蚕微孢子虫全基因组数据,采用基于基因同源性的Darkhorse基因组统计方法,鉴定家蚕微孢子虫基因组中每个基因的来源谱系,并通过全基因组谱系可能性指数(lineage probability index,LPI)分析微孢子虫与其他物种的亲缘关系。结果表明家蚕微孢子虫与其他微孢子虫的LPI加权平均值为0.93,具有最近的亲缘关系,与真菌界的LPI加权平均值为0.65,与原生生物界的LPI加权平均值为0.38。由此证明微孢子虫与真菌存在着更近的亲缘关系,微孢子虫门属于真菌界而非原生生物界。     

家蚕微孢子虫诊断新技术的研究

为了正确诊断家蚕微孢子虫(Nosema bobycis, N.b),共征集了11种微孢子虫作为诊断的材料。根据N.b.孢子(日本株)的DNA序列,设计一对引物,以N.b.DNA为模板进行PCR扩增得到一个约317bp的片段,将此片段克隆到大肠杆菌DH5 α中,提取重组质粒、酶切、回收目的片段,经地高辛标记为探针,对N.b.等11种微孢子虫DNA进行核酸杂交检测,只有N.b.DNA呈阳性反应。检测灵敏度均达到1ng DNA水平。     

家蚕微孢子虫表面抗原蛋白对家蚕致病性的影响

家蚕微粒子病是由家蚕微孢子虫通过食下传染和胚种传染引起的,对蚕业生产影响很大,历来是蚕种的检疫对象,为此对家蚕微孢子虫的研究一直是一个重要课题。除Ｐａｓｔｅｕｒ(1870)提出的母蛾检验外,相继出现了双向免疫扩散法,凝集法,荧光抗体法,酶联免疫吸附法,酶标抗体法,免疫过氧化物酶染色法及单克隆抗体法等方法[1],这些方法各有特色。但基本上都是以识别检测微孢子虫的表面抗原蛋白为基础。河原勇[2]根据微孢子虫表面抗原蛋白的不同将家蚕Ｎｏｓｅｍａ属分为3种类型,即Ｂｏｍｂｙｃｉｓ型、Ｍ11型、Ｍ12型。本文以家蚕微孢子虫的表面抗…     

家蚕微孢子虫的RAPD指纹图谱研究

用70个随机引物对家蚕寄生性微孢子虫的分子标记进行了RAPD扩增。结果:60％的引物产生了扩增多态性;随机引物OPG-11及OPH-08等可区分微孢子虫Nosema bombycis广州株及浙江株,Nosema sp.MG1和MG2、NI,柞Nb。结果表明:RAPD技术可作为区分微孢子虫种、亚种的一种手段。     

龙眼卷叶蛾微孢子虫对家蚕为害的研究

龙眼卷叶蛾微孢子虫对龙眼卷叶蛾自然寄生率达19%左右,龙眼卷叶蛾微孢子虫大小4.1×2.86μm,比N.b孢子略大。龙眼卷叶蛾微孢子虫可为害家蚕,感病率可达100%。症状表现为各龄发育缓慢,眠起不齐,蚕体开差较大,感染后没有明显的病斑,从4龄起发生少量的病死蚕,随后病死蚕逐日增多,至5龄第3~5日大量发生。严重的其存活率仅30%左右,并有少量的胚种传染。     

山东省病原性家蚕微孢子虫的初步研究

从山东省境内家蚕成虫体内分离到 4种病原性家蚕微孢子虫 ,与N .b比较研究结果表明 ,4种微孢子虫的大小、形态、极丝圈数及倾斜角与N .b相比均存在差异 ,但血清学反应及在蚕体内的发育过程与N .b相同。初步认为该 4种病原性微孢子虫为N .b的同属微孢子虫。这 4种微孢子虫对家蚕具有极强的食下感染率和胚种传染力。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)与其它微孢子虫及真菌的进化关系

综述了应用分子生物学和生物信息学对家蚕微孢子虫系统发育的研究进展,以及多菌灵等苯并咪唑类杀真菌剂对微孢子虫和真菌的抑制作用,认为研究家蚕微孢子虫和真菌的进化关系对家蚕微粒子病的控制技术研究具有重要参考价值。     

两株微孢子虫:家蚕微孢子虫和新西兰草金龟微孢子虫的DNA探讨

从各自的微孢子虫基因组获得了两个能分别与家蚕微孢子虫和新西兰草金郇微孢子虫特异杂交的DNA片段,并对其进行了测序。尚没有发现该DNA片段能与供试的其它4个微孢子虫分别来自[蜜蜂微孢子虫、小菜粉蝶的变形孢虫(Vairimorpha sp.),新西兰草金龟和掘孔蛴螬(Wiseana sp.)的两株微孢子虫(Vavraia oncoperae)]的基因组DNA杂交。家蚕微孢子虫探针不与新西兰草金龟微孢子虫基因组DNA或与该微孢子虫原始昆虫寄主家蚕的DNA杂交。同样,新西兰草金龟微孢子虫探针不与家蚕秃孢子虫基因组或与新西兰草金龟的DNA杂交。两个DNA片段富含AT(分别占总碱基的59和79％),G+C/A+T的比率为0.70和0.25,表示其为散布于整个基因组中的重复序列。     

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。     

引用LAMP技术检测家蚕微孢子虫孢子的试验

在家蚕微孢子虫孢子生产检测中引用LAMP技术,比对相应蚕种批次的母蛾镜检和成品卵镜检结果,试验显示LAMP检测对家蚕蚕卵中微孢子DNA的灵敏度完全适用于生产检测的要求,同时前者工作流程耗时大大缩短,相对具有一定优势,但因成本限制,可在一定范围内适用。     

家蚕几种病原微孢子虫的比较研究

从不同地区养蚕生产及桑园害虫中分别收集到四种微孢子虫，ＭＡ—１、ＭＤ—１、Ｐｈａ—Ｍ和Ｈａ—Ｍ。从它们孢子的形态、对蚕的致病性、相互间的血清学关系、在蚕体内的寄生部位和引起的组织与细胞病变以及在蚕体内增殖的生活史等方面与典型的家蚕微粒子病病原Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较研究。结果表明，ＭＡ—１与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ相同；Ｈａ—Ｍ可能亦来源于Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ；ＭＤ—１为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ的形态变异株，定名为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓｍｏｒ．ｖａｒ．；而Ｐｈａ—Ｍ为与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ不同的种，暂称为Ｎｏｓｅｍａｓｐ。     

家蚕微孢子虫PCR检测的研究

根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。     

桑象虫微孢子虫对家蚕的病原性研究

桑象虫(Baris deplanata roeloffs)在浙江、四川、广东、江苏、安徽、山东等蚕区均有危害,一般以越冬成虫在半截枝桩的化蛹穴内越冬,次年春季从化蛹穴钻出,在枝条上活动.一年中对桑树危害有三个时期:①春天冬芽萌动时啃食冬芽;②桑树夏伐后,成虫食害伐条截口以下定芽及潜伏芽;③桑芽开口后,成虫食害嫩梢或叶柄,导致新梢枯萎或折断.桑象虫在桑树上活动,不仅危害桑树生长,而且其感染的病原菌(特别是微孢子虫)亦有可能交叉传染给家蚕,使家蚕感染发病.因此,了解桑象虫微孢子虫对蚕的传染性,对于防治家蚕微粒子病,防止交叉感染意义重大.我们从桑象虫体内分离到一种微孢子虫,对其与家蚕病原性、传染性等方面进行了研究.