转基因家蚕研究进展

本文总结了开展转基因家蚕研究二十多年来采用的实验技术和取得的成果，并指出了各种技术的优缺点。对转基因实验中使用的报告基因和启动子也作了一定的介绍。     

表达小黄鱼生长激素的转基因家蚕品系构建

构建转小黄鱼生长激素基因的家蚕新品系,外源表达鱼生长激素。通过检索小黄鱼转录组序列,获得小黄鱼生长激素和转铁蛋白的编码序列,设计并合成以接头序列连接,N端为生长激素、C端为转铁蛋白的融合蛋白编码框。利用piggyBac转座子介导的转基因方法,将融合基因转入家蚕基因组中,转育得到可表达小黄鱼生长激素且人工饲料摄食性较好的转基因家蚕品系皓月-Fc,蛹体中小黄鱼生长激素表达量最高约为0.27 ng/mg,蚁蚕24 h疏毛率约为85%。构建的转基因家蚕品系为下一步小黄鱼功能性饲料添加剂的研发打下基础。     

家蚕雌特异分子标记筛选、克隆及其序列分析

为了建立家蚕W染色体的特异性分子标记 ,采用RAPD PCR技术对同一品种家蚕雌雄个体基因组DNA进行分子标记筛选。通过 4 5 0种随机引物筛选到 1条雌特异性的DNA片段OPZ0 7 35 5bp ,将该雌特异片段克隆到载体pGEM T上 ,并进行测序和同源性分析 ,结果表明 :该雌特异DNA片段的序列长为 35 5bp ,推测其可能来自于家蚕的W染色体。     

转基因家蚕的研究进展

<正>转基因技术的发展经历了漫长而曲折的过程。最初,人们尝试向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA,但mRNA无法翻译。还尝试过向小鼠囊胚注射SV40的DNA,用反转录病毒感染小鼠胚胎,但效果都不理想。向原核期的小鼠直接注射纯化的DNA得到转基因小鼠,表明用DNA的显微注射可以将外源基因导入小鼠种系中。     

家蚕中肠特异表达基因BmMSEG的进化和功能研究

中肠是家蚕消化管的最主要部分,对家蚕生长、发育以及免疫等具有重要影响。先前基于转录组分析发现,BmMSEG(midgut-specific expressed gene)基因在家蚕中肠特异表达,但是其功能仍然未知。本研究应用qRT-PCR进一步证明BmMSEG在家蚕中肠特异表达。通过CRISPR/Cas9敲除BmMSEG基因,发现敲除个体的中肠出现损伤,并且在5龄幼虫期死亡。最后通过同源搜索和共线性分析,发现BmMSEG的直系同源基因广泛且特异性分布于鳞翅目昆虫基因组中。本研究结果不仅为进一步研究BmMSEG基因导致中肠损伤的作用机制提供了理论基础,而且深入研究可为鳞翅目害虫防控提供新的分子靶标。     

家蚕C-Jun氨基末端激酶基因不同剪接体的发现和表达研究

C-Jun氨基末端激酶(JNK)信号途径在生物体应对内部和外部压力过程中承担重要角色。作者首次在鳞翅目模式昆虫家蚕中发现BmJnk基因存在剪接体。其中1条128bp的外显子可以导致BmJNK蛋白N端的氨基酸序列的差异,产生BmJNKa和BmJNKb 2种氨基酸序列。5龄第3日幼虫多组织表达谱调查结果表明,大造品种的10种组织中都存在剪切体BmJnka和BmJnkb,但2种剪切体在不同组织中的mRNA水平存在差异。家蚕幼虫化蛹变态期间的丝腺退化过程中,BmJNKa和BmJNKb的mRNA转录水平上调,表明BmJNK参与了丝腺消亡过程的调控。37℃高温逆境环境诱导,家蚕BmN细胞中的BmJnka和BmJnkb的mRNA水平上调,表明家蚕BmJnk基因可以通过mRNA水平的表达来应对外界环境压力。     

家蚕RYBP基因的结构与表达模式分析及转基因干涉系统的建立

多梳蛋白(polycomb group,PcG)是一类对生物有机体生长发育很重要的转录抑制因子,参与有机体的发育调控。Ring和YY1结合蛋白(Ring and YY1 binding protein,RYBP)是在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)中推断的PcG蛋白成员。基于生物信息学分析方法,设计引物克隆了家蚕的RYBP基因(BmRYBP);序列结构分析显示该基因有一个420 bp的完整ORF,由3个外显子和2个内含子组成,编码139个氨基酸,预测其蛋白质分子质量为15.4 kD,等电点为10.36,N端的20～44 aa有一个与蛋白间相互作用有关的锌指结构域(ZnF-RBZ);半定量RT-PCR分析显示,该基因在家蚕5龄3 d幼虫生殖腺中高水平转录;基于GAL4/UAS双元系统,构建了具有BmRYBP序列反向重复结构的转基因干涉表达载体,通过显微注射家蚕早期胚胎,获得了UAS系统的转基因家蚕后代,为研究BmRYBP在家蚕生长发育过程中行使的功能奠定了基础。     

基于PCR的转基因家蚕快速识别方法

在转基因家蚕的制作方法中,基于piggyBac转座子的显微注射法是当前最常用和最有效的方法。通过piggyBac转座子方法获得的家蚕,由于其以随机方式切出和转座的特征,所获得家蚕的转入位置往往带有随机性,不可人为预测和控制。利用转基因插入位置的随机性,配合转入的目的基因序列识别,建立了家蚕指纹识别方法。该方法快捷方便,可用于转基因家蚕品种繁育过程中的品系识别和转基因家蚕知识产权的举证手段。     

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

家蚕条件基因打靶技术的建立及应用研究进展

条件基因打靶技术是通过借助位点特异性重组酶和预先引入宿主基因组的重组酶特异识别位点,在宿主特定发育阶段的组织或细胞中实现目标基因时空特异性定点插入、删除、替换和倒位等突变操作的技术。目前条件基因打靶技术已被广泛应用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)等高等真核模式生物的功能基因研究,并逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。近年来,国内外多个研究机构系统地开展了家蚕(Bombyx mori)条件基因打靶技术的开发研究,目前已经建立了较为完善的基于多种不同位点特异性重组系统的家蚕条件基因打靶技术平台。本文较为全面地介绍目前最为常用的位点特异性重组系统的组成和作用原理,系统概述基于位点特异性重组系统的家蚕条件基因打靶策略及其应用,并对家蚕条件基因打靶技术存在的主要问题和发展趋势进行讨论。     

家蚕雌蚕单性生殖无性繁殖系的配合力研究

运用不完全双列杂交法 ,以经 7～ 8代孤雌生殖选育初步育成的雌蚕单性生殖无性繁殖系及其原两性繁殖系 ,分别与平衡致死雄蚕、常规品种雄蚕配制一代杂种 ,在相同条件下比较各组合的生产性能 ,结果表明许多雌蚕单性生殖无性繁殖系的配合力超过其原系统 ,具有较强的杂种优势。因此 ,若利用雌蚕单性生殖无性繁殖系与平衡致死雄蚕组配杂交种 ,将为降低雄蚕品种的制种成本开辟了一条新的途径     

家蚕二化性品种(品系)转基因用蚕卵的预处理技术研究

家蚕为卵滞育昆虫,二化性家蚕品种(品系)的化性由上代卵期温度与光照等调控。将若干个二化性家蚕品种(品系)以17~18℃温度催青诱导子代蚕卵非滞育,筛选出1个经济性状较优的实用品种"秋丰"、1个突变品系P33,二者非滞育卵圈比例分别达到96.4%和89.6%,正常催青的良卵实用孵化率分别达到96.11%和98.58%,解决了采用显微注射法以家蚕实用品种构建转基因系统过程中因蚕卵滞育不能及时孵化的难题。另对利用20%盐酸-2%甲醛混合液刺激解除蚕卵滞育的方法以及非滞育蚕卵表面用70%乙醇消毒的方法进行了尝试,前者可以获得96%以上的孵化率,后者可以缩短蚕卵预处理时间。     

家蚕转基因技术的应用研究

家蚕(Bombyx mori)是重要的经济昆虫,也是生物学研究的模式生物之一,中国在2004年率先发布家蚕基因组框架图,为中国在家蚕分子生物学领域占领了一个制高点。继框架图之后,进行转基因家蚕研究具有重要的理论意义和实用价值,这不仅可以帮助我们了解家蚕基因的结构、功能及表达调控的机制,同时也为研究家蚕生物反应器生产目的蛋白,培育家蚕抗病性新品种,改善蚕丝质量等提供了新的技术途径。本文将重点从家蚕功能基因组的研究、家蚕丝腺生物反应器的应用研究及转基因技术培育家蚕新品种三个方面对家蚕转基因技术的应用进行介绍。随着家蚕转基因技术的深入研究,转基因家蚕技术及产物将会在未来有着更广阔的应用前景。     

家蚕雌蛾体中雌二醇含量的影响因素研究

用放射免疫法研究了家蚕雌蛾体中雌二醇(estradiol,E2)含量在品种、蛾龄、饲养季节间的变化规律等。结果表明:家蚕雌蛾体富含雌二醇,其含量在蚕品种间存在显著差异,在供试的17个品种中,雌蛾体内E2含量相差2.34倍;在刚羽化至自然死亡的不同蛾龄间,随蛾龄增大,E2含量逐渐增加,至自然死亡前一天达最高值,死亡后又下降;不同饲养季节间雌蛾体的E2含量是春蚕蛾>秋蚕蛾>夏蚕蛾;交配对雌蛾体的E2含量无明显影响。     

家蚕雌蛾体中氨基酸的分析

分析了家蚕雌蛾体中氨基酸组成与含量,并对其进行了质量评价。家蚕雌蛾体富含氨基酸,检测到了17种水解氨基酸和15种游离氨基酸。水解氨基酸和游离氨基酸的总含量分别为53．37％和3．637％,其中人体必需氨基酸含量分别为20．36％和0．798％,占氨基酸总量的比值分别为38．15％和21．94％,接近或超过WHO推荐模式。研究结果显示,家蚕雌蛾是开发食品和药品的优质原料。     

家蚕雌蛾粉对阳虚雌性小鼠的药理作用试验

采用肌肉注射氢化可的松建立阳虚雌性小鼠模型,灌胃给予不同剂量家蚕雌蛾粉,并设正常对照组和模型对照组,通过对小鼠自主活动次数、扭体反应次数、游泳存活时间、体重、肝脏系数、脾脏系数、子宫卵巢系数等指标的考察,研究家蚕雌蛾粉的药理作用。发现家蚕雌蛾粉能明显改善阳虚雌性小鼠活动和体重等一般状态,具有明显的精神恢复与镇痛的作用;可提高小鼠游泳存活时间,表现出增强耐力的作用;同时可促进雌性小鼠免疫器官与生殖器官的发育。家蚕雌蛾粉具有明显的类雌激素样生物学活性。     

家蚕雌蛹冷藏对人工孵化处理蚕种质量的影响

家蚕蛹期冷藏是蚕种生产上普遍使用的方法。苏5×苏6(正反交)和苏菊×明虎(正反交)等江苏省现行蚕品种,羽化前日的雌蛹冷藏对蚕种质量有显著不良影响,主要表现为不受精卵率增加,孵化率和孵化整齐度下降。10℃冷藏的影响程度显著超过5℃冷藏,冷藏4d的影响显著超过冷藏2d。雌蛹冷藏对冷藏浸酸卵的孵化率影响显著大于即时浸酸蚕卵,结果显示应避免冷藏家蚕雌蛹,如无法避免,应该尽量将生产的蚕种作即时浸酸使用。     

全天冷藏对家蚕雌蛾产卵及次代经济性状的影响

本试验以家蚕品种"湘·7、芙·9"为试验材料,通过对"湘·7"原种雌蛾冷藏后产卵成绩及其次代蚕的性状表现情况调查,结果表明,雌蛾在6℃温度条件下24h内冷藏完全可行,且对次代蚕的性状表现无明显的负面影响.     

家蚕基因资源品系油蚕突变体的鉴定试验

系统调查了西南农业大学家蚕基因库未知基因的油蚕突变,采用油蚕标志基因系统及幼虫皮肤野生型系统,分别对其中20个系统的油蚕进行了杂交鉴定,结果探明了其中18个系统油蚕的基因座位,即E~(ca)030系统油蚕的基因与od基因为同一座位(1—49.6);L~c000等16个系统的油蚕基因与oc基因为同一座位(5—40.8);o100系统油蚕基因与or基因为同一座位(22—8.9).     

转基因家蚕实验用材料蚕的冷藏期限

为了适应转基因家蚕研究对实验用蚕卵的随时需求,探讨了蚕蛹、蚕蛾耐冷藏期限问题.研究结果发现,蚕蛾羽化后用4℃温度冷藏4 d以内,仍然有能交配和产卵的蚕蛾,获得生长发育正常的蚕卵;蚕蛹冷藏期限在12 d之内,对蚕蛾的交配能力及雌蛾产卵能力影响不大;冷藏期限13～20d,蚕蛾交配能力和雌蛾产卵能力逐渐下降,但如果有足够数量的蚕蛹,仍然能够获得能交配和产卵的蚕蛾,获得生长发育正常的蚕卵.