牛布氏杆菌PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31的基因序列设计特异性引物,对牛布氏杆菌样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为602 bp,与预期扩增序列同源性为99.7％;该PCR检测体系的特异性强,不能在非布氏杆菌 DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为0.9 pg/μL。该检测体系的成功构建为牛布氏杆菌病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

牛早期胚胎的性别鉴定PCR技术的研究

根据牛SRY(Y-染色体性别决定基因)基因序列自行设计合成3对常规PCR引物作为牛性别鉴定特异性引物,对15头公牛、20头母牛的样品进行检测.结果表明,第2对引物可清晰扩增出公牛基因组DNA750 bp左右条带,而母牛基因组DNA无此扩增条带,证明这条引物可以应用于牛的早期胚胎性别鉴定研究与应用.     

奶牛性别鉴定的研究与应用

选取牛雄性性别决定基因SRY (sex region of Y chromosome),根据基因序列设计特异引物,应用PCR技术对5头荷斯坦奶牛DNA样品进行扩增,鉴定其性别;并对设计的引物灵敏度进行检测;对已有的公、母各20头荷斯坦奶牛DNA样品进行PCR盲检,获取奶牛高灵敏度特异性引物,用于奶牛性别鉴定。结果表明,4头公牛DNA样品可以扩增出目标条带(66 bp),1头母牛DNA样品无法扩增出条带,阴性对照扩增无条带;最佳引物灵敏度为1.6 pg/μL,可以很好地满足性别鉴定需要。40头个体中,20头个体DNA样品可以扩增出条带,其余20头个体DNA样品无法扩增出条带,检测结果与实际性别对比准确率为100%。试验结果表明,设计的引物灵敏度比较好,能够满足奶牛性别鉴定的需要。     

利用半套式PCR扩增16S rRNA基因检测牛和猪附红细胞体

根据GenBank收录的猪和牛附红细胞体16SrRNA基因序列设计1对通用引物，在其上游引物内侧叉设计1条分别针对猪和牛附红细胞体的特异性引物。以这4条引物对出现附红细胞体痛典型症状及疑似症状的猪和牛的血样DNA进行半套式-PCR扩增。结果显示，该反应阳性率为58．3％，低于临床解剖和镜检结果。对谈基因的序列测定结果进行分析，表明不同动物附红细胞体的16SrRNA基因同源性在80％以上。从谈基因来看，附红细胞体与立克次氏体没有同源性，而与肺炎支原体和穿透支原体亲垮关系较近。     

肉制品中牛源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成1对引物,以生、熟牛肉为材料,建立了肉制品中牛源性成分的PCR检测方法,并用该法对市售的67份牛肉制品进行检测。结果显示,所检牛源性成分在271 bp处出现预期的条带,扩增片段经Sau3AⅠ酶切分析确认,获得的214和57 bp片段与预期一致;运用该引物均可扩增出水牛肉、牦牛肉、奶牛肉、黄牛肉单一的相同大小的DNA条带,而对羊、马、狗、驴、兔和鸭等14种动物肉的DNA扩增则呈阴性,其检测灵敏度达到53.2 fg/μL DNA;利用该法对67份牛肉制品进行检测,检出率为100％。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

吉林株犬新孢子虫的分离与鉴定

将疑似感染犬新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织接种于Vero细胞进行体外培养,同时感染长爪沙鼠进行动物试验.提取牛流产胎儿脑组织DNA、沙鼠脑组织DNA、细胞培养虫体DNA,用犬新孢子虫特异性引物进行PCR扩增.结果显示,PCR扩增出了1条约为681 bp的目的条带;测序结果表明,扩增出的特异性目的基因序列与GenBank中发表的犬新孢子虫NcSAG1基因(AF113004)核苷酸序列的同源性为99.4%.结果表明,在吉林省牛流产胎儿脑组织中分离出犬新孢子虫.     

简单异尖线虫PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的简单异尖线虫核糖体DNA的内转录区(ITS-1、5.8S、ITS-2)序列设计特异性引物,对线虫样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序.结果表明,扩增的目的片段大小为430 bp,与预期扩增序列同源性为99%.该PCR检测体系的特异性强,不能在宫脂线虫、伪地新线虫DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为0.4 Pg.该检测体系的建立为简单异尖线虫的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持.     

应用巢式POR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp：该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10—7Hg／mL,是单一PCR的10^3倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。     

应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp:该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10-7μg/mL,是单一PCR的103倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。     

从血凝块中提取DNA的快捷方法

将7 mL全血去血清后的血凝块用携带不锈钢均质头的均质器裂解后,加入红细胞裂解液处理至无血凝块存在,得到1 mL左右的白细胞提取物,可较完全地去除红细胞成分。白细胞提取物提取的DNA成分经凝胶电泳分析,可得到较清晰的DNA条带。用牛特异性引物从所有血凝块扩增出271 bp的牛特异性条带,用血凝块处理后的细胞沉淀添加病毒悬液提取的DNA作BHV1病毒gB-PCR检测,结果显示添加BHV1的血凝块样品均出现478 bp的BHV1-gB特异性条带。     

干肉制品中霉菌PCR鉴定方法的建立

为了早期预防传统牛肉干发生霉变,建立了牛肉干中真菌PCR的鉴定方法,在特异性和敏感性方面对所建立的PCR方法进行了验证。其中特异性试验以霉变的鲜牛肉、酵母菌、乳酸球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌为材料进行验证;敏感性试验以霉变的鲜牛肉为材料,提取其DNA并将其稀释成不同的浓度进行PCR验证。结果显示：特异性试验中仅霉菌样品在约300 bp处出现特异性条带,而其他样品在该处无特异性条带出现,表明具有良好的特异性;敏感性试验中,霉菌DNA原液、10倍稀释、100倍稀释、1 000倍稀释时均出现了约300 bp的特异性条带,即霉菌DNA模板稀释度为1 000倍（2 ng/μL）时仍对引物有敏感性。该试验为市场传统牛肉干真菌PCR检测工作提供了依据。     

湖南省牛无浆体虫株分子生物学鉴定

用原虫16 S rRNA基因序列通用引物对湖南5个地区牛无浆体感染的阳性血液样品进行PCR扩增,经测序和序列拼接,获得5个无浆体样品16 S rRNA基因的部分序列,应用分子生物学软件进行分析,并根据所获得序列的保守区间设计特异性引物,进行PCR诊断方法的探讨性研究.结果表明,在通用引物下,5个地区无浆体感染的阳性血液样品均获得1 425 bp大小的虫体16 S rRNA基因条带;测序后5个无浆体16 S rRNA序列同源性均在97%～98%.证明5个分离虫株初步鉴定为牛边缘无浆体.     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成GH-1、GH-2两条引物,分别以IBRV的Barta Nu/67株、IBRVBK125株基因组DNA为模板进行扩增,结果两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对其同属的伪狂犬病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒（HVT）及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）进行扩增均未见特异性条带;敏感性检测表明,该法对IBR病毒的检出限量为104.25TCID50/0.1mL.     

新疆革蜱源性牛无浆体的PCR检测

为了解新疆部分地区优势媒介革蜱类传播牛无浆体的状况,随机采集了吐鲁番、巴州等牛场和放牧牛身上寄生的革蜱(N=140只),以16S rRNA基因为靶标分别设计了无浆体属通用引物(EE1/EE2)和牛无浆体特异性引物(AB1f/AB1r),运用嵌套式PCR方法扩增其全基因组DNA。试验结果显示,在140只革蜱全基因组DNA中,扩增出阳性条带的13只,其牛无浆体的阳性率为9.3%(13/140),这结果被阳性革蜱同一个群的革蜱动物传播试验所验证。经阳性病原DNA的克隆测序、比对后,发现该牛无浆体病原DNA序列与数据库中的西藏株(AF414399)和福建株(DQ324547)相似,其同源性均为99%。试验表明,新疆牛无浆体可能被当地的优势媒介革蜱所携带和传播,该参数可为地方蜱传无浆体病的综合防治提供科学依据。     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeat se和hisJ基因片段的引物序列，设计并合成了2对引物，对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果，沙门菌PCR产物均出现199bp与495bp的特异性DNA扩增条带．而非沙门菌均未出现扩增条带，证明这2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释，测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明，此体系可检出10^3CFU／mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法，对进境鱼粉阳性样品进行了检测，均出现阳性结果。本研究表明，复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法，可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

温氏附红细胞体PCR检测方法的建立

本研究旨在建立1种快速准确检测温氏附红细胞体感染的分子生物学诊断方法。根据温氏附红细胞体的16S rRNA基因参考序列的保守区,利用软件Primer Premier 5.0设计合成了1对特异性引物,对温氏附红细胞体的基因组DNA进行PCR检测。结果表明,扩增出1段985bp的DNA序列,EcoRⅠ酶切鉴定得到2条500bp左右的条带,与预期结果一致,说明该方法扩增出了温氏附红细胞体的特异性条带。通过敏感性、特异性、重复性和临床样品检测试验证明,该方法具有特异、灵敏、快速的优点。结果提示,所建立的方法具有较高的特异性和灵敏性,可用于牛附红细胞体病诊断和流行情况监测。     

应用PCR技术检测禽类源性成分

据禽类(鸽子、鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸵鸟、鹧鸪)线粒体DNA 12sRNA基因中的保守序列,用Primer5.0设计针对禽类动物的特异性扩增引物。通过聚合酶链式反应从禽类样品中得到大约200bp的特异条带,而参考物种牛、羊、马、驴、鱼和空白对照则无此条带,说明该引物只对禽类有特异性,能将禽类与牛、羊、马、驴、鱼区分开来。通过测序对扩增产物进行验证,结果表明:禽类组织的PCR产物序列与基因库中检索到的相应序列相吻合。建立了一种检测禽类动物源性成分的PCR方法,该方法检测的灵敏度为0.1%。     

牛副结核病PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因序列设计特异性引物,对牛副结核分枝杆菌进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为246 bp,与预期扩增序列同源性为99.6%。该PCR检测体系的特异性强,不能在非副结核分枝杆菌 DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为1 pg。该检测体系的成功构建为牛副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

通过CHD基因快速鉴定鸽子性别方法的研究

本试验采用PCR方法,依据性别基因连锁理论,通过羽毛和血液,不提取鸽子基因组DNA,直接利用特异性引物对其CHD基因的特异性片段进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示雄鸽仅有1条带,在700bp左右,雌鸽有2条带,分别在400与700bp左右;利用该检测方法对100羽性别未知的雏鸽进行了性别鉴定,结果为雌鸽48羽、雄鸽52羽,并通过剖解雄鸽的生殖器官进行验证,准确率达到100%。用建立的方法测定了2928羽雏鸽用于蛋鸽留种试验,结果表明,雌鸽为1411羽、雄鸽为1517羽。     

麝属动物源性成分PCR检测方法的建立

为了对麝属动物源性成分进行有效鉴定,根据麝属动物线粒体DNA(mt DNA)序列,使用分子生物学软件Oligo7.0设计了特异性引物,用来建立PCR检测麝属动物源性成分的方法。结果显示:使用麝特异性引物优化的PCR体系可以对两份麝样品进行扩增,凝胶电泳均出现特异性条带。方法特异性好,只扩增麝属动物样品,16份其他物种的样品均为阴性结果。方法灵敏度较高,可检测到100个拷贝DNA的数量级。表明本研究建立的方法可应用于动物组织及其加工产品中的麝属动物源性成分的检测。