大麦黄矮病毒GAV株系通读蛋白基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

 以大麦黄矮病毒 ( BYDV) GAV株系的 RNA为模板 ,通过 RT- PCR扩增获得通读蛋白 ( readthrough protein　RTP)基因的目的片段。将其重组到 p GEM- 7zf( + )并转化 JM1 0 9得到了含有完整 RTP基因的重组子。采用双脱氧终止法进行序列分析。结果表明 ,RTP基因为1 377nt,与文献〔1〕报道的血清学较密切的 BYDV MAV- PS1相比 ,核苷酸和氨基酸的同源性分别为 87.4%和 87.1 %。将此 RTP基因克隆到原核表达质粒 p ET- 5a上 ,在大肠杆菌 BL2 1( DE3)中用 IPTG诱导表达 ,利用分离包含体的方法结合 SDS- PAGE电泳 ,得到了纯化的分子量为 66ku的非融合蛋白     

大麦黄矮病毒GPV株系运动蛋白基因原核表达载体的构建

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因编码一种17 kDa的蛋白,利用一对特异性引物,通过RT-PCR对ORF4基因进行了扩增,序列测定表明其长度为456 bp,与已报道的序列一致,并构建了原核表达载体。     

大麦黄矮病毒PAV河南分离物通读蛋白ORF5基因的分子特征分析

利用RT-PCR从河南各地采集的110份小麦病样上鉴定出28个大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruse,BYDV)PAV分离物,并获得了这28个分离物的通读蛋白(Read through protein, RTP)ORF5基因全长.通过氨基酸序列比对可知,河南分离物RTP-ORF5基因变异普遍较大,28个BYDV-PAV河南分离物RTP-ORF5基因之间的核苷酸序列一致性为75.9%～100%,氨基酸序列一致性为79.4%～99.8%,核苷酸和氨基酸的一致性变异都较大.与国内外报道的16个BYDV-PAV通读蛋白基因相比对,其核苷酸序列一致性为72.2%～99%,由此推导的氨基酸序列一致性为77%～99.6%.系统进化分析显示河南地区分离物在4个内组群中都有分布.这些数据说明河南的大麦黄矮病毒PAV多样性丰富.     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和移动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat protein,CP)和移动蛋白(Movement protein,MP)基因序列合成了CP和MP基因的上下游引物,通过PCR扩增获得目的片段,经过Sal I和Pst I双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序,构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP,用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白,为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子和克隆寄主因子,以及其种类和功能打下坚实的基础.     

大麦黄矮病毒运动蛋白在烟草中的瞬时表达

[目的]快速鉴定运动蛋白基因在烟草中的瞬时表达,进一步研究该外源基因的功能。[方法]将大麦黄矮病毒的运动蛋白基因定向克隆到马铃薯X病毒载体上,得到重组的马铃薯X病毒,电击转化农杆菌后,利用农杆菌渗透注射技术注射到本生烟草的叶片中,观察病毒对烟草的侵染状况。[结果]渗透注射后第7天观察,重组病毒载体侵染的烟草系统叶有病毒侵染症状,而对照组未有此现象。对2组试验进行逐日跟踪观察,重组病毒载体侵染的烟草有较严重的病毒侵染症状和叶片卷曲现象,后期引起注射叶及系统叶坏死。而空病毒载体侵染的烟草只有轻微的病毒侵染症状,并能够恢复健康。对侵染的烟草进行RT-PCR检测,结果表明外源基因BYDV-MP在烟草体内进行了正常的转录和表达。[结论]BYDV-MP蛋白促进了PVX的系统侵染速度,加重了系统侵染的病毒症状,是病毒病症的决定因子;利用PVX表达载体表达异源MP的方法是可行的。     

大麦黄矮病毒合肥分离物的鉴定及CP基因进化分析

[目的]为了明确合肥地区大麦黄矮病毒株系种类及分子变异情况。[方法]利用生物学手段和RT-PCR方法鉴定了2009年采自合肥地区的19个分离物,并测定了分离物的外壳蛋白基因（CP基因）的序列。[结果]合肥地区的12个分离物被鉴定为BYDV-PAV,CP基因序列比对发现核苷酸一致性为95.8%～99.7%。系统进化树分析得知,12个合肥分离物序列聚类到一个分支上,它们与中国分离物PAV-CN（AY855920）的CP基因亲缘关系最近。[结论]掌握合肥地区大麦黄矮病毒的株系分布及分子变异情况,对指导该地区小麦黄矮病的抗性育种和防治工作有着非常重要的意义。     

大麦黄矮病毒运动蛋白在烟草中的瞬时表达(摘要)(英文)

[目的]快速鉴定运动蛋白基因在烟草中的瞬时表达,进一步研究该外源基因的功能。[方法]将大麦黄矮病毒的运动蛋白基因定向克隆到马铃薯X病毒载体上,得到重组的马铃薯X病毒,电击转化农杆菌后,利用农杆菌渗透注射技术注射到本生烟草的叶片中,逐日跟踪观察病毒对烟草的侵染状况。[结果]重组的PVX病毒载体进行PCR鉴定和双酶切鉴定(BamHI+XhoI),均得到了462bp的基因片段,证明外源片段BYDV-MP确实克隆到了PVX病毒载体GR107上。将含有重组的PVX病毒载体GR107-MP和空的PVX病毒载体GR107的农杆菌渗透缓冲液注射到5～6叶期的烟草幼苗后,第7天观察,重组病毒载体侵染的烟草系统叶有病毒侵染症状,而对照组未有此现象。对2组实验进行逐日跟踪观察,重组病毒载体侵染的烟草有较严重的病毒侵染症状和叶片卷曲现象,后期引起注射叶及系统叶坏死。而空病毒载体侵染的烟草只有轻微的病毒侵染症状,并能够恢复健康。对侵染的烟草进行RT-PCR检测,结果表明外源基因BYDV-MP在烟草体内进行了正常的转录和表达。[结论]BYDV-MP蛋白促进了PVX的系统侵染速度,加重了系统侵染的病毒症状,是病毒病症的决定因子;利用PVX表达载体表达异源MP的方法是可行的。     

大麦黄矮病毒株系间分子变异与系统进化关系研究

对已公布的45条大麦黄矮病毒( Barley yellow dwarf virus,BYDV)全基因组进行比对分析,表明BYDV具有2种基因组结构类型.依据45条全基因组序列和59条外壳蛋白(CP)基因序列分别建立BYDV系统进化树,表明PAV株系可分为3个亚组,且发现中国的PAV与欧美的PAV间存在明显的分子差异.M...     

大麦黄矮病毒的生物信息学分析

[目的]分析大麦黄矮病毒(BYDV)株系的生物学信息,为深入研究BYDV各株系的遗传特性及防治提供参考.[方法]从NCBI数据库搜索BYDV的全基因组序列,利用DNASTAR 7.1对其进行序列比对分析,并以MEGA 7.0构建BYDV系统发育进化树.用CodonW分析BYDV的密码子使用偏好性;运用NCBI中的E-Utilities工具搜索BYDV各株系的基因及蛋白,采用SWISS-MODEL预测BYDV蛋白的三级结构.[结果]BYDV各株系碱基序列相似性存在明显差异,其中PAV株系组内核苷酸序列最低相似性最低,仅为77.9%,表明该株系全基因组序列变异较多.PAV、Ker-II、GAV和RPV株系存在碱基突变,均以C—T碱基突变数目最多,且碱基变异倾向于碱基转换.BYDV各株系分为五大分支,其中分离地相近的株系或同一株系BYDV间亲缘关系较近,来自法国克尔格伦群岛的Ker-II株系与PAV株系亲缘关系较近,来自美国的MAV株系与来自我国的GAV株系亲缘关系较近,来自我国的GPV株系(NC-012931)与美国的RPV、RMV和RPS株系亲缘关系较近.BYDV密码子使用无明显的偏好性.PAS、MAV和GAV株系的基因组中均包含7个基因,而PAV株系基因组包含8个基因.在BYDV各株系gp1~gp4蛋白中,gp4蛋白的三级结构保守性最强,而gp1蛋白的空间结构发生一定变异,正是不同BYDV株系的传播媒介及对寄主植物侵染能力存在差异的原因.[结论]BYDV各株系普遍发生分子变异,但变异程度不同,以PAV株系变异程度最大;推测GPV和RMV株系隶属于马铃薯卷叶病毒属.     

The Cloning and Sequencing of Read-through Protein Gene from BYDV-GAV Virus

The cDNA of BYDV-GAV read-through protein (RTP) gene was amplified from the extracted RNA of BYDV-GAV by using the polymerase chain reaction (PCR), and cloned into pGEM-7zf( + ). Its complete nucleotide sequence was determined by dideoxynucleotide chain-termination method. The BYDV-GAV RTP gene consists of 1377nt. Its sequences were most similar to that of the RTP gene of BYDV - MAV with identities of 87.4% and 87.1% at the nucleotide and amino acid levels, respectively.     

Cloning and Sequencing of the Pokeweed Antiviral Protein Gene and Its Expression in E. coli

The total RNA was isolated from pokeweed (Phytolacca americana ) leaves using the method of guanidine isothiocyanite and used as a template to amplify the deleted mutant pokeweed antiviral protein (PAP) gene by RT-PCR and then the gene was cloned into the pGEMR-T vector. The sequencing results showed that the PAP gene consisted of 711nt, which was 99.6% identical to the PAP gene reported by Lin et al (1991). The IPTG-inducible expression vector containing the PAP gene was constructed and transferred into the E. coli strain BL21 (DE3)-plysS. A specific protein was produced after induction with 0.4m mol/L IPTG and its molecular weight was 26ku. The results of the double diffusion on the agar plate and the western blotting test showed that the protein produced in E. coli was highly identical with the PAP extracted by a Frenchman from French pokeweed leaves. These revealed that PAP gene was actually achieved and exactly expressed in E . coli.     

猪囊尾蚴18kD蛋白基因的克隆及其序列分析

为在体外获得高纯度的猪囊尾蚴病的诊断抗原,克隆了猪囊尾蚴18kD蛋白的基因,并对其核苷酸和氨基酸序列进行了分析,揭示了18kD蛋白为一种分泌表达蛋白,为该蛋白的体外表达提供了基础。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的原核表达

[目的]为VP1蛋白的免疫学研究和鸡贫血病毒基因工程疫苗的研制奠定基础。[方法]将1个新克隆的鸡贫血病毒vpl基因（AF448446）在大肠杆菌DE3中进行表达,并对该蛋白进行纯化。[结果]结果表明：已成功构建了表达载体pET30（b^＋）-vp1;VP1蛋白已成功诱导表达并得以纯化;获得的VP1蛋白序列与已发表的VPl蛋白序列存在差异。[结论]试验克隆的vp1基因大小为1347bp,编码449个氨基酸的蛋白。     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白（N）基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T．1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31（DE3）感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39．866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10％的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。     

鸡新城疫病毒洛阳分离株HN基因的克隆和序列分析

应用RT PCR技术从新城疫病毒洛阳分离株中扩增HN的cDNA片段,并将其克隆至pMD18 T载体进行核苷酸序列测定。结果表明:新城疫分离株HN基因片段长度为1716bp,编码571个氨基酸;推测出的氨基酸序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基;与国内外的14株新城疫毒株HN基因相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为66.4%~98.5%和87.8%~98.3%;与标准毒株Lasota和Clone30的亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸差异性较大,而与天津分离株和云南分离株的亲缘关系较近,基本属于同一基因群。     

水貂株犬瘟热病毒融合蛋白基因的克隆与序列分析

以犬瘟热病毒水貂分离株RNA为模板,经RT-PCR反应,扩增出融合蛋白基因的1053bp DNA片段,通过T-A克隆技术,成功构建克隆载体PMD-18T/F。序列分析表明:分离株与01-2689株、2544-Han95株、A75-17株、DOGDK91C株、00-2601株、ONP株、PDV-2株核苷酸序列同源性分别为94.3%、93.5%、94.4%、93.6%9、5.3%、97.3%和94.5%;氨基酸序列同源性分别为97.2%、96.6%、97.4%、97.4%、97.4%、97.2%和98.0%。抗原指数分析表明分离株与疫苗ONP株、强毒A75-17株在40-50位氨基酸间存在明显差异。