急性病毒性坏死病毒IAP-86基因的克隆、表达及抗凋亡研究

在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86,将重组质粒转化到E.coil BL21(DE3)中,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40 ku,经Western-blotting和质谱分析证明,该蛋白即为IAP-86融合蛋白,Co2+柱纯化后得到了纯化的IAP-86融合蛋白。将重组的IAP-86蛋白用FITC标记,荧光显微镜下观察,发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合。细胞凋亡检测实验发现,重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡,凋亡抑制率为7%。本实验应用原核表达成功得到了IAP-86蛋白,并证明IAP-86对栉孔扇贝细胞的凋亡有一定抑制作用,这为进一步研究AVNV的侵染机制提供依据。     

魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表达分析

通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆得到魁蚶(Scapharca broughtonii)C型凝集素(C-type lectin,Sb-Lec1)基因,该基因全长为700 bp,其中,5′-UTR为29 bp,3′-UTR为167 bp,开放阅读框长度为504 bp,编码167个氨基酸,包括长度为23个氨基酸的信号肽序列、129个氨基酸的糖识别结构域(CRD)以及参与二硫键形成的6个半胱氨酸。预测蛋白分子量为19.11 k Da,理论等电点为4.74。多序列比对结果显示,Sb-Lec1基因CRD编码的氨基酸序列与长牡蛎(Crassostrea gigas)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和海湾扇贝(Argopecten irradians)C型凝集素的同源性分别为38%~40%、34%~35%和38%~39%,Sb-Lec1基因编码的氨基酸序列与其他物种的凝集素基因具有相似的结构,均含有形成二硫键的4个保守半胱氨酸。系统进化分析结果显示,魁蚶先与贝类聚为一支,再与脊椎动物聚在一起,表明魁蚶Sb-Lec1基因在进化树上的位置与其传统分类所处位置一致。采用荧光定量PCR技术,检测了Sb-Lec1基因在组织中的表达情况,发现其在肝胰腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、斧足中均有表达,其中,肝胰腺表达量最高。同时,分析了Sb-Lec1基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的mRNA表达量变化情况。结果显示,与对照组相比,菌刺激组Sb-Lec1基因mRNA在各检测组织中的表达量均显著上调(P0.05),随着刺激时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势。本研究表明,魁蚶Sb-Lec1基因在机体免疫防御方面发挥重要功能。     

鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用RT–PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆鳜(Siniperca chuatsi)胃蛋白酶原基因cDNA全长序列,并对该基因的结构特征和系统进化关系进行了分析。鳜胃蛋白酶原基因cDNA序列全长1367 bp,5′端非翻译区43 bp,3′端非翻译区187 bp,开放阅读框(ORF)1137 bp,共编码378个氨基酸。鳜胃蛋白酶原氨基末端存在信号肽和激活肽序列,序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。鳜胃蛋白酶原氨基酸序列与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性为59.9%～91.2%,表明胃蛋白酶原基因在脊椎动物的长期进化中比较保守。鳜胃蛋白酶原基因的成功克隆不仅为进一步研究该基因的时空表达奠定基础,而且为鱼类胃蛋白酶原的分子特征和进化提供了新的资料。     

真鲷天然抗性相关巨噬蛋白全长cDNA的克隆与序列分析

Natural resistance associated macrophage protein (Nmmp) is an innate resistance protein to intracellular parasites, which is expressed plentifully in macrophage ceils. Nramp has been studied in mouse, human, cattle, rainbow trout and channel catfish.However, tittle was known about the structure of Pagrus major Nramp. In order to get the complete sequence of Pagrus major Nramp, a pair of primer is designed according to a 200bp known sequence of Pagrus major Nramp cDNA. By the use of SMART RACE, the full Nramp of Pagrus major cDNA about 5 000 bp was obtained, including about 200 bp 5‘ terminal region (UTR),complete encoding region and 3‘ terminal region. There were 3 ployA signals, which showed many possibilities of cutting at 3‘ terminal region. The character of Pagrus major Nramp nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are analyzed. 12 putative transmembrane(TM) regions, a consensus transport motif (CTM), a predicted protein kinase C phosphroylation site and three predicted N-link glycosylation sites are indicated in its deduced amino acid sequence. The ‘consense transport motif‘ CTM is located etween TM8 and TM9. Furthermore, a protein kinase C phosphroylation site and three N-link glycosylation sites were predicted. The lignment of amino acid sequences between Pagrus major Nramp cDNA and several animals is analyzed and the deduced amino acid equence of Pagrus major Nrarnp had 77.8%, 83.0%, 82.3%, 80.0%, 81.1%, 60.4%, 70.3%, 58.5%, 69.5% identity ith rainbow trout α(AAD20721), rainbow trout β(AAD20722), channel catfish(AF400108), fathead minnow (AAF01778),common carp (CABal96), mouse 1 ( AAA39838 ), mouse 2 ( AAC42051 ), human 1 ( D50403 ), human 2 ( NP - 0(106(18 ),respectively. The alignment reveals high conservation in TM and CTM regions. Analysis result makes us get familiar with the structure nd character of fish Nramp, furthermore, offers some infonnat/on for the enhancement of immunity of fish and genetic amelioration on fish breeding.     

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RTPCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1 483 bp,由长92 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257 bp的3′非翻译区,和1 134 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9 ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%~99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。     

西伯利亚鲟Sox9基因cDNA全长克隆、序列分析及其表达检测

为了研究Sox9基因在西伯利亚鲟侧线神经发育过程当中所起的调控作用,本研究利用RT-PCR和RACE方法获得了西伯利亚鲟Sox9基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆Sox9cDNA全长为1409bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1083bp,5′端非翻译区(untranslate dregion,UTR)19bp和3′端非翻译区(untranslate dregion,UTR)307bp。1083bp的ORF共编码360个氨基酸,相对分子质量为41221.7U。序列分析表明,其与施氏鲟的亲缘关系较近,其次是斑马鱼。经实时荧光定量PCR技术对西伯利亚鲟Sox9基因在各组织以及在胚胎发育各时期中的相对表达量检测发现,Sox9在西伯利亚鲟中的表达具明显的组织差异性和时间差异性。其中,在肝,肾,肌肉,胰中的相对表达量较低。然而,大脑组织中的表达量与以上4个组织相比,处于极高水平,达到胰脏中相对表达量8.9倍,达到表达量最低点肾脏中的近21倍。在胚胎发育的不同阶段,Sox9均有表达。在原肠期、神经胚期及视泡形成期,Sox9基因的表达量均较高,特别是在原肠期其表达量达到西伯利亚鲟...     

异育银鲫Toll样受体3的cDNA序列分析与蛋白质高级结构预测

利用RT-PCR、RACE及克隆等方法获得了异育银鲫Toll样受体3(cagTLR3)基因全长cDNA序列.该cDNA全长3170 bp,5'端非编码区181 bp;3'端非编码区283 bp;开放阅读框(ORF)2706 bp,编码901个氨基酸.经序列同源性分析显示,其编码的氨基酸序列与金鱼、斑马鱼、斑点叉尾鲴、虹鳟和红鳍东方鲍有较高的相似性,其相似性分别为92%、88%、79%、75%和72%,说明TLR3在长期的进化中具有较高保守性.TLR3全长序列起始21个氨基酸残基为信号肽;50至695个氨基酸残基间包含15个富含亮氨酸的重复序列(LRR);704至726个氨基酸残基为跨膜区(TM);754至897个氨基酸残基为与白介素-1受体高度同源的区域(TIR).将异育银鲫TLR3与人和斑马鱼胞内TIR结构的氨基酸比对后发现,Phe728、Leu738、Tyr756与Arg736在TLR3的信号转导及胞内定位过程中起到关键作用.异育银鲫TLR3胞外配体结合域的三维结构呈U型,与人TLR3的相应结构十分相似,在N端具有1个二硫键,C端有2个.因LRRs上的插入序列和14个糖基化位点,异育银鲫TLR3胞外配体结合域内表面的大量β-折叠结构呈平坦的平面.     

广东紫菜Hsp70基因eDNA克隆与表达分析

为探索广东紫菜(Pyropia guangdongensis)叶状体Hsp70基因在温度刺激下机体耐温相关分子机制,为广东紫菜的栽培生产提供技术参考,本研究利用RACE技术获得了广东紫菜Hsp70基因(PgHsp70)全长序列,并在此基础上采用实时荧光定量PCR技术,研究广东紫菜叶状体分别在不同温度(22℃、27℃和31℃)条件下处理0、1/6、1/2、1、6、12、24和36 h后PgHsp70基因的差异表达。结果显示,PgHsp70基因序列长2004 bp,包含一个1866 bp的开放阅读框,可编码621个氨基酸,预测分子量为67.7 kDa,理论等电点为4.87。基因表达水平定量分析表明,温度对PgHsp70基因表达水平有显著影响,PgHsp70基因在不同温度的表达水平变化趋势基本一致,均呈现先上调后下降的趋势,且均于1 h表达量到达最高水平,其中,在31℃ 1 h表达量最高,为未经高温处理组的11倍,说明PgHsp70基因在应答高温胁迫中发挥着重要的作用。     

翘嘴红鲌PEPCK基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法,分离和克隆翘嘴红鲌（Erythroculter ilishaeformis）磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因的全序列,得到2 564bp[不含poly（A）]的全长cDNA,包括111bp5′非翻译区,1 911 bp阅读框以及含Poly（A）信号AATAAA的542 bp3＇非翻译区[不包括Poly（A）].阅读框共编码636个氨基酸,计算的分子量为69.65 kD.该序列含有PEPCK特有的结合草酰乙酯的结构域以及与GTP三磷酸链和Mg^2＋结合的激酶1和2基序.与其他鱼PEPCK的相似性高达83%～96%,和爪蟾、变形虫等其他动物的相似性为50%～69%.[中国水产科学,2006,13（3）：389 396]     

背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因cDNA全序列克隆及表达分析

采用RACE方法,克隆了背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因的cDNA全序列。结果显示,该cDNA序列全长为870 bp,5'端非翻译区104 bp,3'端非翻译区460 bp,开放阅读框长为306 bp,共编码101个氨基酸,相对分子量为11 166.9 u。同源性分析显示,该基因编码的蛋白与三角帆蚌theromacin基因氨基酸序列的相似度最高,为73%;与贻贝中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins等4种类型相似度较低,属于Macin家族(登录号:KJ598604)。实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足和肠等组织中均有表达,在外套膜中的表达量最高,在其他组织中的表达量较低;经嗜水气单胞菌诱导后,各个组织的表达量出现明显上调的趋势且与对照组显著差异,推测theromacin基因可能在背角无齿蚌的免疫反应中起重要作用。     

锦鲤疱疹病毒ORF72基因克隆及结构功能分析

于辽宁丹东采集感染锦鲤疱疹病毒的活鲤Cyprinus carpio样品,经DNA提取、PCR扩增、重组质粒构建步骤成功克隆锦鲤疱疹病毒ORF72基因,并利用生物信息学软件分析ORF72蛋白结构与功能,构建系统进化树。结果显示:ORF72基因开放阅读框共1113bp,编码蛋白由370个氨基酸组成,理论相对分子质量为40.5KD;ORF72蛋白主要由α螺旋、β折叠、无规则卷曲3种二级结构组成;N端35个氨基酸序列为信号肽序列。跨膜结构分析表明:ORF72蛋白无跨膜区,保守结构域预测表明ORF72含有一个保守结构域,抗原表位分析表明,抗原性较好。结构预测显示:ORF72氨基酸序列存在2个潜在的N-糖基化位点、1个潜在的O-糖基化位点、19个潜在的磷酸化位点。系统进化树分析发现,其与锦鲤疱疹病毒美国株、以色列株属同一分支。     

罗氏沼虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因的克隆及分析

根据已公布的罗氏沼虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因序列设计一对特异性引物,从疑似患白斑病毒病的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中提取总DNA,并以此为模板,经PCR扩增、克隆并测序后将该片段通过GenBank比对,证实为WSSV的VP28基因;与20个已公布的WSSV VP28进行同源性比较,结果显示:从中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、日本对虾、波纹龙虾提取的病毒株聚为一类,印度对虾WSSV VP28为另一类,罗氏沼虾WSSV VP28又单独为一类。根据测序结果推测VP28蛋白的二级结构在氨基酸的7～29区间可能为跨膜螺旋区,且该区域高度保守。